hsa-miR-221-3p 靶基因預(yù)測及生物信息學(xué)分析

李艷麗，譚仕廉，申元英，郭 樂

（大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南 大理 671000）

MicroRNAs（miRNAs）是進(jìn)化上高度保守且廣泛存在于真核生物中的一類非編碼單鏈小RNA 分子，大小為19～25 個(gè)核苷酸，通過與信使RNA（mRNA）結(jié)合抑制靶基因的表達(dá)或翻譯來發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用。目前大多數(shù)研究表明，miRNAs 在其靶mRNA 的3'UTR 處與特定序列結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平誘導(dǎo)靶基因失活降解或蛋白質(zhì)翻譯抑制。研究表明[1，2]，miRNAs 在多種類型的癌癥中差異表達(dá)。全基因組分析表明[3]，50%的miRNA 基因位于與癌癥相關(guān)的基因組區(qū)域或脆弱位點(diǎn)，其中一些已被確定為致癌基因或腫瘤抑制基因，如與瘤周淋巴管生成和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)的miR-221-3p，其被發(fā)現(xiàn)在腫瘤轉(zhuǎn)移進(jìn)展中發(fā)揮作用。人類miR-221-3p（hsa-miR-221-3p）最初是自2003 年被Lim LP 等[4]團(tuán)隊(duì)在斑馬魚中克隆獲得并得到證實(shí)的，同年另一團(tuán)隊(duì)[5]從老鼠神經(jīng)元細(xì)胞中克隆獲得了此基因，2004 年在人類白血病細(xì)胞HL-60中該基因又得到進(jìn)一步證實(shí)。miR-221-3p 在多種實(shí)體瘤和血液系統(tǒng)腫瘤進(jìn)展過程中異常表達(dá)[6-9]，如肝癌、胃癌、肺癌、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、宮頸癌、卵巢癌、乳腺癌、甲狀腺癌、急性髓系白血病等，其發(fā)揮著類似癌基因的作用[10-13]。這提示hsa-miR-221-3p 在腫瘤的發(fā)生中發(fā)揮某些密切調(diào)控作用，這可能會為腫瘤的治療提供新的靶點(diǎn)，因此有必要深入了解hsamiR-221-3p 的調(diào)節(jié)機(jī)制。本研究擬通過生物信息學(xué)分析方法預(yù)測提取hsa-miR-221-3p 靶基因數(shù)據(jù)交集，并對其進(jìn)行GO 功能分析及KEGG 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路富集分析，為hsa-miR-221-3p 及其靶基因在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的調(diào)控機(jī)制提供理論基礎(chǔ)和研究線索。

1 材料與方法

1.1 hsa-miR-221-3p 的基因定位和物種序列保守性的預(yù)測分析 利用在線檢索UCSC（http://genome-asia.ucsc.ed）數(shù)據(jù)庫檢索hsa-miR-221-3p 的基因序列號、染色體定位和基因位點(diǎn)等基本信息；利用miRBase（https://www.mirbase.org/）在線數(shù)據(jù)庫檢索hsa-miR-221-3p 成熟序列并分析其保守性。

1.2 hsa-miR-221-3p 在人類各組織中的表達(dá)分析運(yùn)用miGator v3.0 數(shù)據(jù)庫（http://mirgator.obic.re.kr/）檢索hsa-miR-221-3p 在人類不同組織器官中的表達(dá)量，并且進(jìn)行預(yù)測分析。

1.3 hsa-miR-221-3p 的靶基因預(yù)測 通過Target Scan（http://www.targetscan.org/vert71/）、miRDB（http://www.mirdb.org/）和miRTarBase（http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/php/index.php）靶基因數(shù)據(jù)庫在線預(yù)測hsa-miR-221-3p 的靶基因，對3 個(gè)數(shù)據(jù)庫的預(yù)測結(jié)果繪制維恩圖，得到交集靶基因。靶基因預(yù)測是遵循序列互補(bǔ)這一基本原理，miRNA 的“種子序列”靶基因的3’UTR 通過堿基配對的方式結(jié)合。

1.4 hsa-miR-221-3p 預(yù)測靶基因的GO 和KEGG 富集通路 將hsa-miR-221-3p 預(yù)測的交集靶基因利用DAVID（https://david.ncifcrf.gov/）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO分析和KEGG 信號通路富集分析。GO 分析包括細(xì)胞組分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）和生物學(xué)過程（biological process，BP）3 個(gè)方面；KEGG 富集分析用于分析hsa-miR-221-3p 的34 種交集靶基因KEGG 的富集程度。

1.5 hsa-miR-221-3p 靶基因編碼蛋白質(zhì)之間相互作用分析 為了對交集靶基因進(jìn)行所編碼蛋白質(zhì)之間的相互作用分析，將3 個(gè)數(shù)據(jù)庫預(yù)測hsa-miR-221-3p 的交集靶基因數(shù)據(jù)集導(dǎo)入String 11.0 數(shù)據(jù)庫（http://www.string-db.org），構(gòu)建靶基因編碼的蛋白間相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果

2.1 hsa-miR-221-3p 的基因定位和成熟序列的保守性分析 在線檢索UCSC 數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)hsa-miR-221-3p基因序列號為MIMAT0000278，定位于人類基因組chrXp11.3 染色體，其基因位點(diǎn)在chrX:45746181-45746202 之間，見圖1。通過miRBase 數(shù)據(jù)庫檢索hsa-miR-221-3p 成熟序列并分析其物種保守性，結(jié)果顯示hsa-miR-221-3p 的成熟序列為“AGCUACAUUGUCUGCUGGGUUUC”，此序列在15 種物種間基本一致，該序列在15 種物種進(jìn)化過程中具有高度保守性，hsa-miR-221-3p 可能具有潛在的生物學(xué)功能，見表1。

表1 不同物種中miR-221-3p 的成熟序列

2.2 hsa-miR-221-3p 在人類各組織中的表達(dá)分析hsa-miR-221-3p 在人體部分組織器官中的表達(dá)分析情況見圖2，其中肺組織中表達(dá)量較高，在其他組織中表達(dá)量相對較低。

2.3 hsa-miR-221-3p 的靶基因預(yù)測結(jié)果 利用TargetScan、miRDB 和miRTarBase 這3 種在線數(shù)據(jù)庫預(yù)測到hsa-miR-221-3p 的靶基因數(shù)量分別為497、615 和249 個(gè)。然后通過在線軟件Venny2.1 對上述3 個(gè)數(shù)據(jù)集繪制韋恩圖推導(dǎo)得到交集靶基因共34個(gè)，見圖3；具體靶基因見表2。

表2 hsa-miR-221-3p 調(diào)控的靶基因數(shù)據(jù)集

圖3 TargetScan、miRDB、miRTarBase 數(shù)據(jù)庫預(yù)測hsa-miR-221-3p 的靶基因

2.4 hsa-miR-221-3p 靶基因GO 功能分析 hsamiR-221-3p 的交集靶基因主要存在細(xì)胞的多個(gè)組分，包括多聚核糖體、細(xì)胞核和線粒體外膜等細(xì)胞組分，見表3；hsa-miR-221-3p 的交集靶基因執(zhí)行多種分子功能，主要包括調(diào)控泛素蛋白連接酶的活性、DNA 結(jié)合和RNA 合成調(diào)控等分子功能，見表4；參與內(nèi)在凋亡信號通路的正向調(diào)控、mRNA 加工等多種生物過程，見表5。

表3 hsa-miR-221-3p 預(yù)測靶基因的細(xì)胞組分

表4 hsa-miR-221-3p 預(yù)測靶基因的分子功能

表5 hsa-miR-221-3p 預(yù)測靶基因的生物過程

2.5 hsa-miR-221-3p 靶基因KEGG 通路富集分析對hsa-miR-221-3p 的交集靶基因KEGG 通路富集分析發(fā)現(xiàn)，參與癌癥調(diào)控的靶基因有5 個(gè)，參與PI3K-Akt 信號通路的靶基因有4 個(gè)，見表6。

表6 hsa-miR-221-3p 預(yù)測靶基因的KEGG 信號通路分析

2.6 hsa-miR-221-3p 靶基因編碼蛋白質(zhì)之間相互作用分析 PPI 結(jié)果顯示，hsa-miR-221-3p 的靶基因編碼的蛋白質(zhì)之間形成了復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)互作圖，見圖4。與其他蛋白存在較強(qiáng)作用關(guān)系的靶基因?yàn)锽CL2L11、ESR1、FMR1。

圖4 預(yù)測靶基因所編碼蛋白質(zhì)之間的相互作用分析

3 討論

癌癥是目前造成人類過早死亡的主要原因之一。據(jù)估計(jì)，到2030 年，癌癥患病率可能會增加到2600 萬人左右，并將導(dǎo)致1700 萬人死亡。癌癥可對患者的生活質(zhì)量產(chǎn)生嚴(yán)重影響，給各國帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[14]。目前大量研究表明[15-17]，癌癥的發(fā)生發(fā)展中常常伴隨多種miRNAs 的異常表達(dá)。hsamiR-221-3p 作為致癌基因參與多種腫瘤的形成過程，又因?yàn)槠湓谔囟ò┘?xì)胞中過表達(dá)，已經(jīng)成為實(shí)體瘤和血液系統(tǒng)腫瘤診斷、治療和預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物[12，13，18]。但是hsa-miR-221-3p 在一系列的惡性腫瘤中的作用機(jī)制尚不明確，目前對hsa-miR-221-3p 潛在靶點(diǎn)和相關(guān)通路的分析尚不全面。本研究利用生物信息學(xué)相關(guān)的在線數(shù)據(jù)庫對hsa-miR-221-3p 在人體組織器官中的分布進(jìn)行分析，預(yù)測hsa-miR-221-3p 的靶基因，同時(shí)取得了3 種數(shù)據(jù)庫預(yù)測的交集靶基因，還對其相關(guān)的GO 功能和KEGG 信號通路進(jìn)行富集分析。

本研究結(jié)果表明，hsa-miR-221-3p 的成熟序列在已知的15 個(gè)物種中高度保守，因此推測hsamiR-221-3p 具有重要的生物學(xué)潛能。hsa-miR-221-3p 在多種組織器官的分布分析表明，它在肺部組織中高度富集表達(dá)。另外3 個(gè)數(shù)據(jù)庫聯(lián)合預(yù)測獲得的34 個(gè)交集靶基因廣泛存在多聚核糖體、細(xì)胞核、線粒體外膜等細(xì)胞的5 個(gè)組分，并且執(zhí)行調(diào)控泛素蛋白連接酶的活性、DNA 結(jié)合和RNA 合成調(diào)控等9 種分子功能，同時(shí)hsa-miR-221-3p 參與內(nèi)在凋亡信號通路的正向調(diào)控、mRNA 加工等15 多種生物過程。另外，其交集靶基因顯著富集于癌癥通路和PI3K-Akt 信號通路。PPI 結(jié)果顯示，hsa-miR-221-3p 的交集靶基因編碼的蛋白間形成了復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)圖，BCL2L11、ESR1、FMR13 等3 種靶基因編碼的蛋白質(zhì)間存在較強(qiáng)的作用關(guān)系。

miR-221-3p 在大多數(shù)實(shí)體瘤和血液系統(tǒng)腫瘤的癌細(xì)胞系和腫瘤組織樣本中異常表達(dá)，發(fā)揮著致癌或抑癌作用。miR-221-3p 通過靶向調(diào)控細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子p27 的表達(dá)，使得細(xì)胞周期進(jìn)程加快，促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、集落形成和侵襲，成為非小細(xì)胞性肺癌細(xì)胞生長的一種新的調(diào)控因子[19]。但是當(dāng)miR-221-3p 和miR-126-3p 聯(lián)合作用于下游靶基因PIK3R2 和PTEN，共同阻斷AKT 和CXCR4 信號通路時(shí)可發(fā)揮抗腫瘤功效[17]，這表明miR-221-3p 對肺癌的調(diào)控作用還需要進(jìn)一步探究。miR-221-3p在胃癌細(xì)胞系和腫瘤樣本中均高表達(dá)，通過抑制PTEN 的表達(dá)促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲，發(fā)揮致癌作用[7]。另外，相對單一miR-221-3p，與miR-122-5p 聯(lián)合檢測對胃癌的診斷和預(yù)后具有更重要的臨床價(jià)值[16]。血管生成作為腫瘤進(jìn)展的關(guān)鍵，是治療晚期宮頸癌的重要靶點(diǎn)，宮頸鱗狀細(xì)胞癌中miR-221-3p 通過下調(diào)THBS2 促進(jìn)血管生成和宮頸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[20，21]。由骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源的微囊泡傳遞的miR-221-3p 通過靶向CDKN1C 促進(jìn)急性髓細(xì)胞白血病細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖和侵襲，發(fā)揮致癌作用。

不同于上述miR-221-3p 發(fā)揮顯著致癌作用，Wu Q 等[10]首次揭示miR-221-3p 靶向ARF4 可抑制上皮性卵巢癌細(xì)胞的增殖和遷移，發(fā)揮抑癌作用，因此miR-221-3p 表達(dá)水平恢復(fù)可能是上皮性卵巢癌患者的一種潛在的治療策略。另外，miR-221-3p的下調(diào)及其靶基因PARP1 的上調(diào)與三陰性乳腺癌的預(yù)后不良密切相關(guān)，可作為其預(yù)后診斷的生物標(biāo)志物[11]。miR-221-3p 除了在卵巢癌外，在成神經(jīng)管細(xì)胞瘤中同樣發(fā)揮抑癌作用，miR-221-3p 可通過靶向下調(diào)EIF5A2 誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和凋亡來降低髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖，提示miR-221-3p 可能是成神經(jīng)管細(xì)胞瘤診斷和治療的潛在候選靶點(diǎn)。另外miR-221-3p 在12.3%的MGMT 啟動子-未甲基化的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤病例中表達(dá)上調(diào)，是不良預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物[22]。miR-221-3p 除了在以上惡性腫瘤中發(fā)揮癌基因的作用，對周圍神經(jīng)損傷、心力衰竭和糖尿病性視網(wǎng)膜病變等基礎(chǔ)疾病中亦發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用[23-25]。由此可見，進(jìn)一步深入研究miR-221-3p 的強(qiáng)大調(diào)控功能及其作用機(jī)制是非常有必要的。

綜上所述，miR-221-3p 與人體多種癌組織和癌細(xì)胞的活力和動力密切相關(guān)，miR-221-3p 對腫瘤細(xì)胞增殖的調(diào)控作用取決于癌癥類型，調(diào)控miR-221-3p 及其靶基因的表達(dá)有望成為惡性腫瘤診斷、治療和預(yù)后的一種新的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。