蕨麻根腐病病原菌的分離鑒定及其生物學特性研究

李晨芹，李軍喬*，王鑫慈，牛永昆，曲俊儒

（1.青海民族大學生態環境與資源學院，青海 西寧 810000；2.青海民族大學青藏高原蕨麻研究中心，青海 西寧 810000；3.青海省特色經濟植物高值化利用重點實驗室，青海 西寧 810000）

青藏高原（Qinghai-Tibetan Plateau，QTP）是世界上最高（海拔4000 m以上）和最大的高原（約2.5×106km2），部分青藏高原植物在其高海拔、低溫、晝夜溫差大、缺氧、干旱、土壤貧瘠、強紫外輻射等獨特環境中長期進化而成為青藏高原的特有資源［1-2］。蕨麻（Potentilla anserina）為薔薇科（Rosacrae）委陵菜屬（Potentilla）多年生匍匐草本植物，是青藏高原特有的植物資源，在青海、西藏、甘肅等高寒地區均有分布，且僅在青藏高原等高寒地區根系膨大形成塊根［3-4］。蕨麻富含多種營養成分和生物活性物質，當地以其塊根入藥，具有一定的藥用、食用及生態價值［3］。近年來眾多學者對蕨麻展開了種質資源、栽培管理技術、主效活性成分分析和藥理作用的研究，蕨麻人工種植技術也在不斷更新，其市場價值與發展前景日漸趨顯［4-8］。蕨麻人工栽培規模在不斷擴大，已審定的3個品種在青海、甘肅等地區推廣種植累計約6.67×103hm2，而其帶動的產業是當地農民脫貧致富的新興生態產業。但在青藏高原“暖濕化”的背景下，隨著蕨麻種植面積的擴大和單一品種連作年限的遞增，近年來田間種植的蕨麻也不斷出現塊根腐敗和黑斑的癥狀，直接影響到蕨麻的產量與質量發展［9-10］。病原微生物的繁殖與傳播是根腐病發生的重要原因，而不同地區不同植物根腐病的癥狀因病原物的不同而有所差異［11-12］。大量研究表明根腐病的病原復雜，真菌侵染是病害發生的主要原因，且多與鐮刀菌有關，癥狀多體現為被侵染植株生長緩慢且莖葉枯萎變黃，根部腐爛壞死［13-14］。但當前國內外尚未出現對蕨麻病害的相關研究，為此探究蕨麻根腐病病原菌及其生物學特性對蕨麻人工種植地區病害的預防和控制具有一定的理論研究價值和實踐指導意義。

本試驗對從蕨麻根部分離獲得的一株蕨麻根腐病菌——鐮刀菌Fusarium perseae進行了系統性的研究，包括對其的分離鑒定及生物學特性研究，以期為今后蕨麻根腐病的診斷和防治提供一定的理論支撐。

1 材料與方法

1.1 供試病原菌及回接植物材料

試驗病原菌為本實驗室2020年從青海省湟源縣蕨麻人工種植基地蕨麻（蕨麻5號）根腐病發病部位采用方中達［15］和Qiu等［16］的組織分離法分離所得的一株單孢菌株。回接植物材料為2020年從青海省湟源縣蕨麻人工種植基地采挖帶回實驗室的蕨麻（蕨麻5號）塊根。

1.2 病原菌的致病性檢測

離體回接檢測：采用離體根部接種法進行離體回接致病性檢測［15］。將單孢菌株在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（potato dextrose agar medium，PDA）上25℃黑暗培養7 d至菌絲長滿培養皿。挑選出大小一致、健康且無病害的蕨麻塊根用流水沖洗，再進行充分消毒處理（用75%酒精浸泡1 min，再用現配3.75%活性次氯酸鈉溶液浸泡6 min，然后75%酒精處理0.5 min后用無菌水清洗4次備用）后對其根部進行刺傷處理。用打孔器打好直徑為5 mm的菌餅，將其覆蓋在蕨麻塊根刺傷部位，置于鋪有兩層用無菌水潤濕的濾紙的培養皿中，每皿3個，3次重復，于28℃恒溫培養箱中保濕培養，直至形成明顯病斑后再次分離培養，觀察分離所得菌株，從而判斷其與接種的菌株是否為同一株病原菌。

活體回接檢測：篩選出大小一致、健康且無病害的蕨麻塊根進行消毒處理（消毒方法同離體回接中使用的方法），將其培養成健康植株。配制病原菌株孢子懸浮液（濃度約1×106·mL-1），將其根灌于根部已刺傷處理的蕨麻植株，3次重復，以無菌水為對照，持續觀察其生長狀況直至其形成典型癥狀，從發病部位再次進行病原菌分離培養，觀察所得菌株，從而判斷其與接種的菌株是否為同一株病原菌。

1.3 病原菌鑒定

1.3.1病原菌的形態學特征 將菌株接種于PDA平板上25℃暗培養7 d，觀察菌落顏色、形狀等特征。菌株產孢后在光學顯微鏡下觀察其菌絲、孢子形態，查閱相關文獻資料進行病原菌形態學鑒定［17-18］。

1.3.2病原菌分子生物學鑒定 收集D2菌的菌絲體，采用北京博友順生物技術有限公司提供的自產DNA提取試劑盒提取病原菌DNA（操作依據試劑盒說明書進行），以提取的DNA作為PCR模板，引物為真菌ITS1/ITS4通用引物組合進行PCR擴增，擴增程序為：94℃預變性3 min；94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸2min，30個循環；72℃延伸5 min。PCR擴增產物經1.5%瓊脂糖檢測后由北京博友順生物技術有限公司完成測序，測序結果在GenBank中進行序列比對，用MEGA軟件中的Neighbor Joining（NJ）程序構建系統進化樹。

1.4 病原菌生物學特性研究

1.4.1不同條件對病原菌菌絲生長和產孢量的影響 1）不同溫度、光照及pH值對菌絲生長和產孢量的影響：將菌株置于25℃恒溫培養箱黑暗培養5 d，用無菌打孔器在菌落邊緣打取直徑為5 mm的菌餅若干，接種于PDA培養基上，分別在以下條件下進行培養：置于5、10、15、20、25、30、35℃共7個溫度梯度恒溫黑暗培養；置于連續光照（light，L）、12 h光暗交替（1/2L）、連續黑暗（dark，D）共3種處理下25℃恒溫培養；置于p H值為3、4、5、6、7、8、9、10、11、12的培養基共10個pH梯度恒溫黑暗培養，5 d后采取十字交叉法測量菌落直徑并記錄菌落生長狀況。7 d后取每皿4塊直徑為5 mm的菌餅，用1 mL無菌水洗脫孢子，進行血球計數板孢子計數，3次重復。

2）不同碳源、氮源、培養基對菌絲生長和產孢量的影響：將菌株置于25℃恒溫培養箱黑暗培養5 d，用無菌打孔器在菌落邊緣打取直徑為5 mm的菌餅若干，分別接種于不同條件的培養基進行培養：以Czapek培養基為基礎培養基，置于不同碳源培養基上培養，碳源分別為C1（缺碳對照）、C2（葡萄糖）、C3（蔗糖）、C4（乳糖）、C5（可溶性淀粉）、C6（果糖）、C7（甘露醇）共7種處理；以Czapek培養基為基礎培養基，置于不同氮源培養基上培養，氮源分別為N1（缺氮對照）、N2（甘氨酸）、N3（磷酸二氫銨）、N4（硝酸銨）、N5（硫酸銨）、N6（蛋白胨）、N7（牛肉浸膏）、N8（硝酸鈉）共8種處理；置于不同的培養基上培養，分別為蕨麻煎汁培養基（JM）、添加葡萄糖作為碳源的蕨麻煎汁培養基（JMC）、添加硝酸鈉作為氮源的蕨麻煎汁培養基（JMN）、LB培養基（LB）、PDA培養基（PDA）和Czapek培養基（CZ），于25℃黑暗培養，5 d后采取十字交叉法測量菌落直徑并記錄菌落生長狀況。7 d后取每皿4塊直徑為5mm的菌餅，用1 mL無菌水洗脫孢子，進行血球計數板孢子計數，3次重復。

1.4.2菌絲致死溫度測定 將直徑為5 mm的菌餅分別置于裝有5 mL無菌水的試管中，將試管分別置于40、45、50、55、60、65、70℃的恒溫水浴鍋中，水浴10 min后轉接到PDA培養基，于25℃恒溫黑暗培養，3次重復，觀察菌絲生長，確定致死溫度范圍，再按1℃溫度梯度進行上述處理確定最終的菌絲致死溫度。

1.4.3不同條件對病原菌分生孢子萌發的影響 1）分生孢子萌發時間的測定：配制濃度為10～20個孢子·視野-1（10×40倍）的分生孢子懸浮液進行分生孢子萌發試驗，25℃保濕培養，在0～60 h（間隔4 h）檢查孢子萌發情況，測定孢子萌發率（隨機檢測100個孢子萌發情況）確定最佳萌發時間。

2）不同溫度、光照及pH值對分生孢子萌發的影響：將分生孢子置于不同的溫度、光照及pH值的條件下進行分生孢子萌發試驗（所用培養基為PDA液體培養基），各處理同1.4.1，于最佳萌發時間（試驗測得為48 h）后測定孢子萌發率。

3）不同碳源、氮源、培養液對分生孢子萌發的影響：將分生孢子置于不同碳源、氮源、培養基條件下進行分生孢子萌發試驗（所用培養基均為對應的液體培養基），各處理同1.4.1，于最佳萌發時間（48 h）后測定孢子萌發率。

1.5 數據統計與分析

試驗數據采用Excel 2019和SPSS 22.0軟件進行統計分析及作圖。對數據進行單因素方差分析（采用Duncan新復極差法），試驗數據以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 病害癥狀描述

蕨麻根腐病的發病部位主要為蕨麻的根部。植物在發病初期地上部分變化不明顯，部分莖葉表現為枯萎變黃，根部出現明顯的黑褐色病斑。隨著病情加重，蕨麻根部褐變明顯、受害面積增大，甚至出現軟化、腐爛現象。后期植株莖葉枯萎變黃加重，地下部分可見白色菌絲附著，根部腐爛壞死（圖1）。

圖1 蕨麻根腐病癥狀Fig.1 P.anserina root rot symptoms

2.2 病原菌的分離與致病性檢測

通過常規組織分離法對發病蕨麻塊根進行分離、單孢純化，得到多株真菌菌株，將培養性狀、菌絲和孢子形態一致的分離物合并編號為D2。將菌株D2根據柯赫氏法則分別接種于離體根部和活體盆栽蕨麻植株上，觀察并記錄發病情況。將菌株D2接種到離體的蕨麻塊根上，與對照相比有傷口和無傷口的蕨麻塊根均具有發病癥狀，產生褐色病斑，長出致密的白色菌絲，塊根出現腐爛跡象（圖2）。將菌株D2接種在盆栽蕨麻植株上，7～15 d后植株染病出現萎蔫變黃現象，根莖處密集菌絲，塊根處有黑褐色斑點，發病癥狀與田間相似，對照不發病（圖3）。對離體和活體回接后發病病樣的病斑與健康部位交界處再次分離，獲得與原接種分離物一致的病原菌。根據柯赫氏法則可以確定菌株D2為蕨麻根腐病的病原菌。

圖2 菌株D2致病性測定結果（離體回接）Fig.2 Pathogenicity determination results of strains D2（in vitro inoculation）

圖3 菌株D2致病性測定結果（活體回接）Fig.3 Pathogenicity determination results of strains D2（in vivo inoculation）

2.3 病原菌的形態學鑒定

D2菌株在PDA培養基上生長較快，5 d可長滿全皿。菌落正面為白色絲絨狀，基物為肉粉色（圖4a和b）。在光學顯微鏡下觀察，D2菌絲為有隔菌絲，直徑為4.0～5.0μm（圖4c）。單瓶梗產孢，分生孢子梗樹枝狀（圖4d）。大型分生孢子呈鐮刀形，中部細胞寬頂胞漸尖，大小為14.9～30.0μm×4.2～5.3μm（圖4e）。小型分生孢子多為單細胞，橢圓形（圖4f）。厚垣孢子間生于菌絲之間，多為串生球形，直徑4.5～8.7μm（圖4g）。根據病原菌的菌落特征、分生孢子及厚垣孢子的形態特征，結合相關文獻資料，初步確定D2為鐮刀菌屬的真菌。

圖4 菌株D2在PDA培養基上的菌落形態及顯微形態Fig.4 Colony and microscopic mor phologies of D2 on PDA medium

2.4 病原菌的分子生物學鑒定

利用引物ITS1/ITS4對菌株D2進行特異性擴增，在約500 bp處有特異性片段。將擴增產物進行測序，得到的序列經BLAST比對分析，選取相似性較高的序列用MEGA（5.10）軟件的Neighbor Joining程序構建系統進化樹，置信度（Bootstrap）經1000次重復抽樣檢驗構建的聚類樹。結果顯示，該病原菌與F.perseae（NR 164415.1）聚在一起，遺傳距離最近，親緣關系密切（圖5）。結合前期的形態學特征，綜合分析鑒定該病原菌為F.perseae。

圖5 菌株D2的系統發育樹Fig.5 Phylogenetic tree of D2

2.5 病原菌的生物學特性

2.5.1不同條件對病原菌菌絲生長和產孢量的影響 1）不同溫度、光照及pH值對菌絲生長和產孢量的影響 D2菌絲對溫度（圖6A）的適應范圍較廣，菌絲和產孢范圍均在5～35℃。菌絲生長的最適溫度為25℃，5 d菌落直徑為5.28 cm；最適產孢溫度為30℃，7 d產孢量為6.10×107·mL-1；低于5℃菌絲基本不生長，低于15℃產孢量也極少。光照（圖6B）對D2菌株生長具有一定的影響，菌絲在黑暗條件下生長最快，12 h光暗交替利于菌落產孢，產孢量達8.82×107·mL-1。D2菌絲在pH 3.0～12.0內均可生長（圖6C）且生長狀況良好，在pH值為7.0時菌落直徑達最大值，為5.13 cm，在pH值為3.0時菌落直徑達最小值，為1.88 cm。在p H 3.0～12.0，D2產孢量曲線呈單峰型，隨pH值的增大而先增后減，在pH值為9.0時達到峰值（5.02×107·mL-1）。

圖6 不同生物學特性對菌株D2菌絲生長和產孢的影響Fig.6 Effects of different biological characteristics on mycelium growth and sporulation of strain D2

2）不同碳源、氮源和培養基對菌絲生長和產孢量的影響：D2菌株能利用多種碳源、氮源，且在多種培養基上均能生長并產孢，部分培養基可以使菌絲體產生具有一定差異的顏色。

供試碳源（表1和圖7）以C2（葡萄糖）最為適合菌絲生長，菌絲生長速率和豐度都是最佳的；其次是C7（甘露醇）、C3（蔗糖）和C6（果糖）；C5（可溶性淀粉）菌絲生長速率較高但菌絲豐度低，C4（乳糖）不利于菌絲生長。其中，以葡萄糖為碳源的培養基上菌絲體呈草綠色，以可溶性淀粉為碳源的菌絲為深綠色，以蔗糖和甘露醇為碳源的菌絲為墨綠色。供試碳源都顯著利于D2產孢，其中以C6（果糖）最顯著，產孢量達2.63×107·mL-1，其 次 是C5（可 溶 性 淀 粉）和C3（蔗糖）。因此可推測鐮刀菌D2侵入蕨麻植株能利用其體內的光合產物進行生長與繁殖。

圖7 菌株D2在不同碳源培養基上的菌落形態Fig.7 Colony morphologies of D2 on different carbon source medium

表1 不同碳源對病原菌菌絲生長及產孢的影響Table 1 Effects of different carbon source on mycelium growth and spor ulation

供試氮源（表2和圖8）以N8（硝酸鈉）、N2（甘氨酸）和N7（牛肉浸膏）適合菌絲生長，而N5（硫酸銨）、N4（硝酸銨）和N3（磷酸二氫銨）不利于菌絲生長，菌絲生長速率受到顯著抑制。菌絲在供試氮源培養基上均較為致密，其中以N2（甘氨酸）和N7（牛肉浸膏）為氮源生長的菌絲體呈現為墨綠色。供試氮源利于D2產孢，其中以N5（硫酸銨）最顯著，產孢量達3.2×107·mL-1，其次是N7（牛肉浸膏）和N3（磷酸二氫銨）。因此，在氮源的利用方面，D2菌株的菌絲生長表現為對有機氮和硝態氮的有效利用更好，而對銨態氮的利用則更利于其產孢。

圖8 菌株D2在不同氮源培養基上的菌落形態Fig.8 Colony morphologies of D2 on different nitrogen source medium

表2 不同氮源對病原菌菌絲生長及產孢的影響Table 2 Effects of different nitrogen source on mycelium gr owth and sporulation

供試培養基（表3）中D2在JMC和PDA培養基上的菌絲生長和產孢情況均顯著優于其他培養基，菌落直徑分別可達5.18和5.28 cm，產孢量分別為3.53×107和3.52×107·mL-1。CZ培養基對D2菌絲生長速率的影響與JMC和PDA培養基并無顯著差異，但產孢量卻顯著減少。

表3 培養基對病原菌菌絲生長及產孢的影響Table 3 Effects of medium on mycelium growth and sporulation

2.5.2菌絲致死溫度測定 D2菌絲在35～60℃恒溫水浴10 min后能在PDA培養基上繼續生長，當溫度條件高于65℃后不能生長，初步確定D2菌絲致死溫度為60～65℃。在60～65℃以1℃為梯度設置6個溫度梯度繼續試驗，結果顯示菌絲在60～63℃仍可生長，64和65℃水浴處理10 min后的D2菌絲不能生長，因此可確定D2致病菌的菌絲致死溫度為64℃，10 min（圖9）。

圖9 菌絲致死溫度Fig.9 Fatal temperature of mycelium

2.5.3不同條件對分生孢子萌發的影響 1）分生孢子萌發時間測定：經60 h的連續觀察記錄發現D2孢子從4 h后開始萌發，48 h后孢子萌發達到峰值且趨于穩定，之后系列分生孢子萌發相關試驗均以此為基礎進行（圖10）。

2）不同溫度、光照及pH值對分生孢子萌發的影響：D2菌株的孢子萌發的溫度范圍為10～35℃，孢子萌發率曲線呈單峰型，隨溫度的增大而先增后減，在溫度為25℃時達到峰值，為95.33%，在30～35℃孢子萌發率較低（低于30%）（圖10）。光照對孢子萌發的影響差異顯著（P＜0.05），其中12 h光暗交替不利于孢子萌發（孢子萌發率為48.67%），其次是全光照條件下孢子萌發率為60.67%，表明光照條件不宜于D2菌株的分生孢子萌發。在pH 3.0～12.0內D2菌株孢子均可萌發，但不同pH值條件對孢子萌發率的影響差異顯著，其中最適pH值為7.0，在pH值為3.0和4.0時，孢子萌發率較低，約為20%。

3）不同碳源、氮源和培養液對分生孢子萌發的影響：供試碳源、氮源對D2菌株孢子萌發的影響具有一定差異（圖10E和F）。C4（乳糖）和C6（果糖）促進孢子萌發，且效果顯著高于其他供試碳源，其次為C5（可溶性淀粉）、C7（甘露醇）和C2（葡萄糖），C3（蔗糖）對孢子萌發無顯著促進效果。N2（甘氨酸）、N7（牛肉浸膏）和N6（蛋白胨）促進孢子萌發，且效果顯著高于N3（磷酸二氫銨）、N4（硝酸銨）和N5（硫酸銨），而N8（硝酸鈉）對孢子萌發無顯著促進效果，說明有機氮利于其孢子萌發。6種培養液中PDA能顯著促進D2菌株孢子萌發，萌發率在48 h達95.33%；其次是JMC，萌發率為73.33%；LB、JMN和JM培養的孢子萌發率均在40%～60%；CZ培養的孢子萌發率在48 h僅為1.67%，幾乎不萌發（圖10 G）。

圖10 不同生物學特性對菌株D2孢子萌發的影響Fig.10 Effects of different biological characteristics on spore germination of strain D2

3 討論

本研究結合形態學、分子生物學和致病性驗證方法鑒定出一株引起蕨麻根腐病的鐮刀屬病原真菌（F.perseae）。該真菌于2020年由Kerry等［19］基于系統基因組學等將Neocosmospora perseae更名為F.perseae。Miettinen等［20］在2018年報道N.perseae能引起意大利梨樹潰瘍病，其余均未見報道。致病性研究發現人工接種供試菌株D2后蕨麻發病癥狀與蕨麻根腐病田間癥狀一致，且該菌株致病力較強，在蕨麻非損傷情況下亦可侵染。目前對鐮刀菌屬真菌引起植物根腐病的研究較多，青藏高原地區普遍種植的紫花苜蓿（Medicago sativa）及三七（Panax notoginseng）等根莖類藥用經濟作物均有大量報道根腐病受害嚴重，其易傳染、難防治的特性給作物栽培田間管理帶來巨大的壓力［21-23］。

除此之外，本研究對該菌株也進行了較為系統的生物學特性研究，不同的營養成分對其生長影響具有一定差異性，菌落形態、生長速率、菌絲豐度、色素沉積、產孢量及孢子萌發等都與菌株離體培養條件密切相關。鐮刀菌對寄主植物的侵染受到外部環境條件的影響，適宜的環境促進病原菌菌絲的生長及孢子的萌發，利于其侵染寄主植物［12］。研究表明，D2菌株對環境條件有較強的適應性，可耐高低溫、酸堿，能利用多種碳源、氮源。D2菌株尤其適于25～30℃生長、產孢及孢子萌發，菌絲致死溫度為64℃（10 min），因此可以考慮在蕨麻塊根收獲后采用溫水浸種或高溫愈傷處理阻止病原物對無性繁殖體的侵染與危害，避免帶病塊根播種后病害在田間的蔓延。pH能影響微生物對營養物質的吸收和酶的活性，甚至改變環境中養料的可給性［24］。該菌的pH適應范圍廣，弱堿條件更利于其生長和產孢，因此在蕨麻人工種植時也應適當地關注田間土壤的酸堿性。鐮刀菌D2侵入蕨麻植株能很好地利用其體內的光合產物，對多種形式的碳源都表現出較好的利用效果。而在氮源利用方面，均表現為能更好地利用有機氮進行生長與繁殖，菌絲生長表現為相較于銨態氮對硝態氮的有效利用更好。蕨麻人工種植地與牧民放牧區重疊度較高，而水肥管理與病害消長關系極為密切，因此應當加強水肥管理以防止蕨麻根腐病的發生與蔓延，合理選擇氮肥種類，注意田間衛生管理，做好蕨麻根腐病的預防工作。

本研究的鐮刀菌系首次報道可以侵染蕨麻引起蕨麻根腐病的病原菌。明確了鐮刀菌屬菌株F.perseae引起的蕨麻根部病害的癥狀及其生物學特性，通過對致病菌的分離鑒定及對其溫度、p H、碳氮源等條件的分析研究，為生產中診斷和防治蕨麻根腐病提供了理論依據，也為后續相關研究提供了一定的理論參考。根腐病病原復雜，已有研究發現部分鐮刀屬真菌病原物具有寄主專化性，該菌株是否具有寄主專化性還需進一步研究［25-26］。同時關于蕨麻品種抗病性鑒定及大田防治方法等也需進一步開展研究。眾多研究發現植物根腐病多數存在多種病原菌協同作用導致病害發生的情況，而鐮刀屬真菌在復合侵染中通常占據優勢地位，因此未來還需擴大開展對蕨麻根腐病致病菌的分離鑒定及相互關系探究等工作［27-28］。