抗壞血酸和水楊酸丸衣對NaCl脅迫下紫花苜蓿種子發芽特性的影響

歐成明，趙美琦，孫銘，毛培勝

（中國農業大學草業科技學院，草業科學北京市重點實驗室，北京 100193）

紫花苜蓿（Medicago sativa）是一種多年生豆科牧草，因為其具有抗逆性好、優質高產等特點，被譽為牧草之王［1］。紫花苜蓿通過生物固氮的作用能對土壤進行改良［2］，不僅有較高的經濟利用價值，對生態環境的保護和修復也有很大的利用價值，在我國農業、畜牧業發展和保護生態環境中發揮著重要的作用［3］，被廣泛種植在鹽堿地、灘涂地以及土壤退化地區進行土地改良和草原恢復。

鹽脅迫作為一種主要的非生物脅迫，對植物種子的萌發、植物生長的速率、植物的光合作用等大部分生理代謝過程都會造成影響［4］，尤其影響種子萌發和幼苗生長，在玉米（Zea mays）［5］、油菜（Brassica napus）［6］、燕麥（Avena sativa）［7］的研究中發現，當鹽濃度到達某一閾值時種子的發芽勢、發芽率降低，幼苗長度縮短，種子活力降低。郭湘等［8］進行了苜蓿耐鹽性研究，結果表明當NaCl濃度達到250 mmol·L-1時，胚根生長受到顯著抑制；種子萌發過程中的滲透調節能力下降，抗氧化酶活性降低，活性氧大量積累，種子萌發和幼苗生長受到明顯抑制［9］。種子包衣技術是一種能增強種子抗逆性，促進種子萌發的種子處理技術，研究發現用黃腐酸、胺鮮酯和微肥對苜蓿種子進行包衣處理，能有效提高出苗率［10］；用腐熟羊糞對老芒麥（Elymussibiricus）種子進行包衣處理，可以提高種子活力和幼苗的抗逆性［11］，用脫硫石膏和粉煤灰對野牛草（Buchloe dactyloides）種子進行包衣處理，可以提高野牛草種子在鹽堿地的發芽率［12］。目前，國內外工廠的膜衣、殼衣和丸衣等包衣工藝已經很成熟，但針對不同逆境條件促進種子萌發的丸衣技術，一直都是牧草種子加工研究與實踐的重點。

氧化脅迫是植物響應鹽脅迫的一種形式，鹽脅迫會使植物體內活性氧（reactive oxygen species，ROS）增加，過量的ROS會對脂類物質進行攻擊，造成細胞損傷［13］。抗壞血酸（ascorbic acid，AsA）是一種普遍存在于動植物組織中的抗氧化劑，也叫維生素C，化學名是L-蘇糖型-六-2-烯醇-1內酯［14］。AsA是許多物質代謝和氧化還原反應的重要參與者［15］。用AsA處理種子能有效清除種子體內的ROS，防止細胞衰老，增強種子抗逆性，提高種子活力［16］。水楊酸（salicylic acid，SA）是一種植物內源激素，普遍存在于植物體內的酚酸類物質，學名鄰羥基苯甲酸。研究表明，SA可以通過誘導逆境相關蛋白的表達等來緩解逆境脅迫對植物的影響［17］。用SA對植物葉片和種子進行處理，能提高植物對鹽脅迫、干旱脅迫、低溫脅迫的抵抗能力，提高種子的活力和幼苗成活率［18-19］。

AsA和SA提高植物耐鹽性的研究主要集中在種子引發和外源噴施，用于種子丸衣的研究較少。因此，本試驗以植物鹽脅迫影響機制為基礎，采用不同濃度的AsA和SA進行丸衣處理，通過分析NaCl脅迫下丸衣種子的萌發情況和種苗的生長變化，以期獲得具有耐鹽性能的紫花苜蓿種子丸衣配方，增強紫花苜蓿種子在鹽脅迫下的萌發能力，旨在提高鹽脅迫下紫花苜蓿播種效率，提高鹽漬土地的利用效率，為天然草地改良和人工草地建設提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用的紫花苜蓿種子是由酒泉大業種業有限責任公司提供的中苜1號紫花苜蓿種子（2017年收獲），種子初始含水量4.3%，千粒重2.153 g，發芽勢90%，發芽率97%，死種子1%，硬實種子2%。試驗于2018年進行。

1.2 試驗設計與處理

1.2.1NaCl脅迫濃度篩選 將紫花苜蓿未丸衣種子在不同NaCl濃度下進行紙上發芽試驗，NaCl濃度（質量分數）梯度設置為0、0.50%、1.00%、1.25%、1.50%，每個處理重復4次。

1.2.2丸衣處理 用1、2、4、8 mmol·L-1AsA和1、5、10、20 mmol·L-1SA溶液對紫花苜蓿種子進行拌種（藥種比1∶100），然后進行丸衣處理［20］（分別記為PAA1、PAA2、PAA4、PAA8和PAS1、PAS5、PAS10、PAS20；未丸衣種子為CK1，不做拌種處理的丸衣種子記為CK2）。

1.2.3丸衣種子耐鹽性能評價 在1.2.1篩選出的NaCl濃度下，對1.2.2丸衣種子進行紙上發芽試驗，4次重復，測量并計算種子的發芽勢、發芽率、種苗長、苗重和平均發芽時間。

1.3 試驗方法

1.3.1含水量調整 因為紫花苜蓿種子含水量太低，為使含水量達到同一水平，需要進行含水量的調整，根據樣品種子的初始含水量（4.3%），按照下述方法調整，目標含水量為10%。具體調整方法如下：考慮平衡速度，選擇KNO3飽和溶液進行水分的調整。稱取0.1 kg KNO3放入大燒杯中，加入1 L蒸餾水，充分攪拌，確保燒杯底部有結晶析出后，將溶液過夜放置，確保溶液已經達到飽和狀態。稱取干凈飽滿的紫花苜蓿種子，質量記為W0，計算出達到相應含水量時種子的質量，記為W。將種子放入74μm的篩子中，貼上標簽，放入干燥器，頻繁稱取其質量，達到要求后立即將種子密封于鋁箔袋中保存于4℃冰箱中備用。達到要求含水量的種子質量：

式中：MC0為初始含水量；MCr為需達到的含水量；W0為初始種子質量（g）。

1.3.2發芽試驗 參照牧草種子檢驗規程（GB/T 2930.4-2017）紫花苜蓿丸衣種子發芽標準進行紙上發芽試驗，選取紫花苜蓿丸衣種子100粒，將其放入盛有3層濾紙的11.5 cm×11.5 cm有蓋培養皿中，設4次重復，未丸衣種子為對照（CK）。將培養皿放置于光照培養箱（GXZ-380B-LED，寧波江南儀器廠）中，在20℃恒溫，光照8 h和黑暗16 h條件下培養。初次計數為第4天，末次計數為第10天。統計正常種苗數、不正常種苗數、新鮮未發芽數、硬實種子數和死種子數，待第10天發芽結束后，計算發芽勢、發芽率。培養期間每24 h統計種子發芽情況，以胚根突破種皮2 mm為標準，計算平均發芽時間。

式中：t為發芽時間；n為在時間t時，新發芽的種子數。

丸衣種子發芽方法同上。

1.3.3種苗生長指標測定 發芽10 d結束后，每個重復隨機選取10株種苗測量種苗長度（cm）和鮮重（g），重復4次。

1.4 數據統計與分析

采用SPSS 20.0進行二因素方差分析和單因素方差分析（ANOVA）做平均值多重比較（Duncan），顯著水平為0.05。

2 結果與分析

2.1 NaCl脅迫對紫花苜蓿未丸衣種子發芽的影響

結果表明，NaCl脅迫影響了紫花苜蓿種子的萌發，延長了平均發芽時間，降低了發芽勢和發芽率；種苗長和鮮重也顯著（P＜0.05）降低。在NaCl濃度為0.50%時，紫花苜蓿種子的發芽勢、發芽率和種苗鮮重與CK處理差異不顯著（P＞0.05），而平均發芽時間顯著（P＜0.05）延長，種苗長顯著（P＜0.05）降低（表1）。當NaCl濃度達到1.00%時，種子的發芽勢、發芽率、種苗長和種苗重都顯著（P＜0.05）下降，平均發芽時間顯著（P＜0.05）延長。1.25%和1.50%濃度的NaCl顯著（P＜0.05）影響了種子發芽率（表1），發芽率分別下降到了56%和24%。因此以這兩個濃度作為鹽脅迫濃度進行丸衣處理的篩選。

表1 NaCl脅迫對紫花苜蓿種子發芽的影響Table 1 Effects of NaCl str ess on alfalfa seed ger mination

2.2 NaCl脅迫對紫花苜蓿AsA丸衣種子發芽和種苗生長的影響

用AsA對紫花苜蓿種子進行丸衣處理，結果表明，在1.25%和1.50%NaCl脅迫條件下，AsA丸衣可以提高種子的發芽率（表2）。在0 NaCl處理中，CK1種子的發芽勢和發芽率都最高，丸衣處理顯著（P＜0.05）延長了平均發芽時間，丸衣種子處理間發芽率和平均發芽時間差異不顯著（P＞0.05）；在1.25%NaCl處理中，CK1種子發芽率最低，為56%，顯著（P＜0.05）低于丸衣種子。PAA1種子發芽勢最高，為20%，顯著（P＜0.05）高于其他丸衣處理和CK1；在1.50%NaCl中，CK1種子發芽率最低，和CK2間差異不顯著（P＞0.05），且顯著（P＜0.05）低于PAA1、PAA4、PAA8處理，其中PAA4處理發芽率最高，其次是PAA8，發芽率分別為46%和43%。PAA2處理種子平均發芽時間最長，除PAA1外，顯著（P＜0.05）大于其他處理（表2）。

通過不同濃度NaCl處理，在紫花苜蓿AsA丸衣種子出苗后，測定其種苗生長情況。在0 NaCl條件下，CK1的種苗長顯著（P＜0.05）大于PAA8處理，但與其他處理間差異不顯著（P＞0.05）；在1.25%和1.50%NaCl脅迫下，PAA4處理的種苗長度均達到最大，而且在1.50%NaCl時，顯著（P＜0.05）大于其他處理，且種苗重也是最大，但與其他處理無顯著（P＞0.05）差異。在1.25%NaCl中，各處理間種苗重無顯著（P＞0.05）差異，而在沒有NaCl脅迫時，AsA丸衣處理可以不同程度的增加種苗重量（表2）。綜上，紫花苜蓿AsA丸衣的最佳耐鹽配方為PAA4（4 mmol·L-1AsA）。

方差分析結果表明（表3），NaCl脅迫和丸衣處理對紫花苜蓿種子發芽勢、發芽率、平均發芽時間和種苗重都有顯著（P＜0.05）影響。NaCl脅迫和AsA丸衣處理在影響種子發芽勢、發芽率、平均發芽時間和種苗重上有顯著（P＜0.05）互作效應。

2.3 NaCl脅迫對紫花苜蓿SA丸衣種子發芽和種苗生長的影響

方差分析結果表明，NaCl脅迫和SA丸衣處理在影響種子發芽勢、發芽率、平均發芽時間和種苗長上有顯著（P＜0.05）互作效應（表3）。用不同濃度的SA對紫花苜蓿種子進行丸衣處理，在0 NaCl，CK1的發芽勢和發芽率最高，平均發芽時間最短；CK2處理的發芽勢最低，平均發芽時間最長。在1.25%NaCl時，PAS1的發芽勢和發芽率最高，為17%和72%；PAS20發芽率最低，為50%，其他處理間差異不顯著（P＞0.05）（表2）。用SA處理的丸衣種子平均發芽時間顯著（P＜0.05）大于CK1和CK2，在1.50%NaCl時，PAS1處理的發芽率顯著（P＜0.05）高于其他處理，為42%，CK1和CK2的發芽率分別為24%和30%，隨著SA濃度的增大，丸衣種子的發芽率逐漸降低；SA丸衣處理不同程度的延長了種子平均發芽時間（表2）。

表3 NaCl和丸衣對紫花苜蓿種子發芽影響方差分析Table 3 Analysis of variance of NaCl and pelleting on germination characters in alfalfa seed

在紫花苜蓿SA丸衣種子出苗后，測定其種苗生長情況。在0 NaCl時，PAS5處理的種苗長小于其他處理，其他處理間差異不顯著（P＞0.05）；丸衣不同程度地增加了種苗重量（表2）。在1.25%NaCl時，PAS5處理的種苗長顯著（P＜0.05）大于CK2，其他處理間無顯著（P＞0.05）差異。在1.50%NaCl時，除了PAS20以外，其他SA處理的丸衣種子的種苗長顯著（P＜0.05）大于CK1和CK2；PAS5處理的種苗重顯著（P＜0.05）大于PAS10和PAS20，其他處理間無顯著（P＞0.05）差異（表2）。

表2 不同含量AsA或SA對紫花苜蓿丸衣種子發芽的影響Table 2 Effects of differ ent contents of AsA or SA on ger mination in alfalfa pelleted seeds

綜上，紫花苜蓿SA丸衣的最佳耐鹽配方為PAS1（1 mmol·L-1SA）。

3 討論

鹽脅迫是一種常見的非生物脅迫，能夠抑制植物種子的萌發，影響幼苗的生長發育。在高粱（Sorghum bicolor）［21］、黃瓜（Cucumissativus）［22］、小麥（Triticum aestivum）［23］、水稻（Oryza sativa）［24］等作物種子研究中發現，鹽脅迫會不同程度的抑制植物種子的萌發。本試驗結果也發現，隨著NaCl濃度的增加，紫花苜蓿種子的發芽勢、發芽率逐漸降低，當NaCl濃度達到1%時，發芽勢和發芽率顯著（P＜0.05）下降，平均發芽時間顯著（P＜0.05）延長，苗長和鮮重也呈下降趨勢。種子在萌發過程中受到鹽脅迫時，會誘導活性氧的產生，同時會抑制抗氧化酶的活性，導致自由基無法被清除而大量累積，進而使細胞膜上的不飽和脂肪酸過氧化，損傷細胞膜結構，影響細胞膜功能，從而抑制種子的萌發［25］。

AsA是一種普遍存在于動植物組織中具有傳遞電子和質子能力的抗氧化劑，是許多物質代謝和氧化還原反應的重要參與者［14-15］。研究表明，用0.5 mmol·L-1AsA對青豆（Pisum sativum）種子進行浸種處理，可以提高種子活力和幼苗生長性能［26］。董秋麗等［27］采用NaCl溶液（濃度為0、50、100、200 mmol·L-1）、AsA溶液（濃度為0、0.5、1.0、1.5、2.0 mmol·L-1）處理燕麥種子，研究發現，NaCl脅迫降低了燕麥種子的活力水平，隨AsA濃度的增加，燕麥種子的發芽率在100和200 mmol·L-1的NaCl脅迫下呈先升后降的趨勢，1 mmol·L-1的AsA引發對NaCl脅迫的緩解效果最好，這說明AsA引發對NaCl脅迫的緩解作用與其濃度有關，適宜的濃度能有效緩解NaCl脅迫。并且用AsA浸種處理對不同濃度的NaCl脅迫緩解作用也不同［28］，本試驗的交互作用結果也說明了這一點，當NaCl濃度增加到1.25%和1.50%時，AsA丸衣可以不同程度地提高紫花苜蓿種子的耐鹽性。其中，在NaCl濃度為1.5%時，配方PAA4處理的效果最好，顯著（P＜0.05）提高了在此鹽脅迫濃度下種子的發芽率。這說明種子在萌發過程中受到一定程度鹽脅迫傷害時，適宜濃度的AsA處理才會起到緩解作用，因此，不同的種子對NaCl脅迫的耐受性不同，相應地AsA處理的濃度也不完全相同。研究表明，NaCl脅迫會導致植物種子內活性氧的快速產生，而外源AsA可以促進酶促和非酶促抗氧化作用，有效清除鹽脅迫產生的活性氧，從而提高植物種子耐鹽性，促進萌發及幼苗生長［29］，而鹽脅迫的程度和外源AsA作用時機的關系和作用機理還有待進一步的研究。

SA是一種重要的信號分子，通過調節細胞抗氧化機制、誘導逆境相關蛋白的表達等來緩解外界脅迫對植物的影響［17］。在低溫［30］、鹽堿［31］、蟲害［32］等逆境脅迫下，通過外源SA處理可以增強苜蓿抵抗逆境脅迫的能力。因此，利用SA對種子進行處理，研究鹽脅迫下種子的萌發特性，對提高種子抗逆性和種子發芽能力具有重要意義。但SA處理的濃度與物種有關，馬齒莧（Portulaca oleracea）種子在200 mmol·L-1的NaCl脅迫下，種子的發芽勢和發芽率大大降低，1 mmol·L-1的SA處理可以提高種子各項發芽指標，對種子萌發有促進作用［33］。0.1～0.4mmol·L-1SA可以緩解鹽脅迫對水飛薊（Silybum marianum）種子造成的傷害，而當SA濃度大于0.6 mmol·L-1時，對種子萌發產生抑制作用［34］。另外，李防洲等［35］在研究棉花（Gossypium hirsutum）抗寒性時，發現1～10 mmol·L-1SA包衣能提高其抗寒能力，而過低或過高都沒有很好的效果。本試驗方差分析結果也表明（表3），NaCl和AsA濃度存在顯著（P＜0.05）的交互作用，低濃度的SA處理（PAS1）可以提高NaCl脅迫下種子的發芽率和種苗重，而高濃度的SA處理（PAS20）的發芽率和種苗重則是最低。通過比較說明，植物種子對于鹽堿脅迫的耐受性不同，相應地SA處理的濃度也不完全相同，并且種子對SA的濃度較為敏感，適宜的SA濃度可以緩解鹽溶液的脅迫，而過高則會產生抑制作用。研究表明，SA處理通過提高幼苗內超氧化物歧化酶、過氧化氫酶等細胞保護性酶的活性，從而提高蒲公英（Taraxacum mongolicum）［36］、三角葉濱藜（Atriplex triangularis）［37］對鹽脅迫的抵抗能力。因此，低濃度SA處理可能未能激發種苗體內抵抗鹽脅迫的保護酶活性，而過高濃度的SA則可能破壞了種苗內部的生理代謝過程，由此推測SA通過提高保護酶的活性來緩解鹽脅迫的危害，而SA與保護酶響應鹽脅迫的調控機制還有待進一步的研究說明。另外，SA對鹽脅迫下種子萌發的影響也可能與種子本身所含的內源激素種類、分布及濃度不同有關。

4 結論

通過外源抗氧化劑AsA、植物激素SA拌種后進行紫花苜蓿種子丸衣處理，發現AsA和SA型丸衣可以提高紫花苜蓿種子的耐NaCl脅迫能力，篩選確定4 mmol·L-1AsA（PAA4）、1 mmol·L-1SA（PAS1）分別為最佳耐鹽處理。