氨基酸分析儀測定貓糧中牛磺酸含量

談暠媛，胡 深，周 平，鄭 強，文靜靜，馮超林

（湖北省獸藥監察所/湖北省畜禽產品質量監督檢驗測試中心，武漢 430070）

中國寵物相關行業發展迅速，寵物飼料營養和質量安全受到大眾關注。牛磺酸是動物必須的非蛋白質含硫氨基酸，主要以游離狀態存在于組織間液和細胞內液中［1］，具有豐富多樣的生理功能，在抗氧化，免疫調節，抗細胞衰老方面有顯著的功效［2］，對于寵物貓十分重要［3-6］。飼料中牛磺酸的檢測方法主要是高效液相色譜法［7］，缺點是前處理需要衍生，毒性大，操作復雜，耗時，影響因素較多。本研究建立了使用氨基酸分析儀檢測寵物飼料中牛磺酸含量的方法，利用了牛磺酸水溶性的特點，以水為提取液，經離子交換柱層析分離，通過茚三酮反應顯色，用外標法定量檢測出其含量。該方法前處理過程快速簡單，不需要衍生，較為適宜貓糧中牛磺酸含量測定。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備

氨基酸自動分析儀L-8900（日本日立）；AE-240電子天平（瑞士梅特勒）；高速冷凍離心機。

1.2 藥品與試劑

牛磺酸標準品（CHEM SERVICE，批號8103700）；鹽酸（國藥集團化學試劑有限公司，分析純）；茚三酮顯色溶液（日本和光純藥株式會社）；氨基酸分析儀配套緩沖液。

1.3 標準品溶液配置

標準儲備溶液的配制：精密稱取牛磺酸標準品10.00 mg，用適量的水溶解，定容至10 mL 容量瓶，配成濃度為1 mg/mL 的標準儲備溶液。

混合標準工作液的配制：取適量的標準儲備溶液，用0.02 mol/L 鹽酸溶液稀釋成適當濃度的標準工作液，現配現用。

1.4 試驗方法

1.4.1 試驗條件 離子交換柱，4.6 mm×60.0 mm（填料為離子交換樹脂，日立2622 sc）；反應柱，不銹鋼柱（填料為石英砂，日立855-3533）。交換柱柱溫57 ℃，反應柱柱溫136 ℃，緩沖液流速0.4 mL/min，茚三酮流速0.35 mL/min。檢測波長570 nm，循環時間20 min，采集時間30 min，進樣量20 μL。

1.4.2 標準曲線的繪制 準確量取適量的標準儲備液，分別稀釋成1、2、5、10、25、50 μg/mL 的標準工作液，供儀器分析；進樣量為20 μL，每個濃度重復檢測2 次；取其平均峰面積值為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線；擬合，求標準曲線方程和相關系數。

1.4.3 樣品的提取 精密稱取樣品約1.00 g，置于25 mL 離心管中，加適量水，加熱至60 ℃，超聲提取30 min，用水定容至25 mL。將樣品溶液6 000 r/min離心10 min，取上清液5 mL，加入0.04 mol/L 鹽酸溶液5 mL，混勻后過0.22 μm 濾膜。

2 結果與分析

2.1 線性關系

在濃度為1～50μg/mL，牛磺酸的峰面積與其濃度呈良好的線性關系，線性方程y=240 590x+23 946，R2=0.999 8。具體見表1、圖1。

圖1 牛磺酸的標準曲線

表1 標準曲線的濃度與峰面積

2.2 儀器精密度

配置牛磺酸標準溶液10 μg/mL，連續6 次進樣，峰面積相對標準偏差為2.65%。結果見表2、圖2。

表2 精密度試驗

圖2 牛磺酸標準品色譜

2.3 定量限和檢測限

以牛磺酸標準溶液的色譜響應值計算，當信噪比（S/N）為3 時，測得儀器的檢出限為0.15 μg/mL，換算得到方法的檢測限為7.5 mg/kg；當信噪比（S/N）為10 時，測得儀器的定量為0.50 μg/mL，方法的定量限為25.0 mg/kg。

2.4 回收率、精密度及空白試驗

以貓糧為空白樣品，分別在樣品中添加牛磺酸進行回收試驗，添加濃度相當于50、100、250 mg/g，每個濃度5 個平行。結果見表3、圖3。可見，使用氨基酸分析儀測定貓糧中牛磺酸含量的方法較為可靠。

表3 回收率測定結果

圖3 空白樣品色譜

2.5 測定方法分析與驗證

以本研究建立的氨基酸分析儀法測定貓糧中牛磺酸含量（方法1）與用農業部2483 號公告-5-2016飼料中牛磺酸的測定-高效液相色譜法（方法2）測定的結果相近（表4），說明使用氨基酸分析儀測定貓糧中牛磺酸的含量的方法準確可靠。

表4 樣品中牛磺酸含量測定結果比較 （單位：mg/kg）

由于寵物飼料的特殊性，16 種氨基酸常和牛磺酸同時存在。試驗證實見圖4，牛磺酸與16 種氨基酸的混標可以互不干擾。用氨基酸分析儀測量牛磺酸的同時可以測量氨基酸的含量。通過氨基酸酸水解的方法處理寵物飼料［8］，可以提取牛磺酸。加標回收試驗發現牛磺酸使用氨基酸酸水解的方法回收率比建立的用水溶解牛磺酸的方法要低。在牛磺酸含量低的樣品中，本底的影響較大，導致酸水解處理方法的回收率不理想，但是在牛磺酸含量高的樣品中，2 種提取方法結果相差不大，可以用酸水解法同時提取樣品中牛磺酸和氨基酸，用氨基酸分析儀同時測量牛磺酸和16 種氨基酸的含量。

圖4 牛磺酸和16 種氨基酸的混合標準品檢測情況

3 小結與討論

試驗結果表明，氨基酸分析儀可以用于寵物飼料中牛磺酸的含量測定，該方法比高效液相色譜法測量省略了衍生的步驟，可直接進行測定，安全無毒性，減少污染，節省時間，操作簡單。用氨基酸分析儀測量寵物飼料中牛磺酸的方法簡單快速，在濃度為1～50 μg/mL，牛磺酸的峰面積與其濃度呈良好的線性關系。該方法豐富了寵物飼料中牛磺酸的含量測定，可為研究寵物飼料中牛磺酸的含量提供技術參考。