鹽穗木正丁醇萃取物對金黃色葡萄球菌的影響

伍麥爾·麥海提，古力拜克然木·阿吾提

（1.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團塔里木動物疫病診斷與防控工程實驗室，新疆阿拉爾 843300；2.阿克蘇地區(qū)動物疫病控制診斷中心，新疆阿克蘇 843000；3.阿克蘇地區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所，新疆阿克蘇 843000）

鹽穗木（Halostachys caspica）是黎科（Chenopodi?aceae）鹽穗屬（HalostachysC.A.Mey）植物［1］，分布于吐魯番的托克遜、南疆的塔克拉瑪干沙漠（英吉沙、阿克蘇、和田）及其周邊荒漠地區(qū)［2］，生長在荒漠及半荒漠的沙漠地、鹽堿地、湖泊等。鹽穗木對鹽堿地有較好的耐受性，具有耐鹽、耐堿、耐干旱、沙埋、抗風(fēng)等特點［3］。鹽穗木常應(yīng)用于荒漠、半荒漠地區(qū)的防沙固土、控制沙塵暴、改善環(huán)境條件［4］等。

南疆地區(qū)氣候干燥，生態(tài)脆弱，沙漠化和鹽堿化很嚴重。飼料資源短缺阻礙了當?shù)匦竽翗I(yè)的發(fā)展，鹽穗木的飼料作用在一定程度解決了這個困難。粗飼料是草食家畜飼料中直接影響動物生長和生產(chǎn)性能的組成成分。鹽穗木具有較大的飼料和藥物價值，含有可溶性鹽分、灰分、粗蛋白，能滿足家畜動物的營養(yǎng)需求，用鹽穗木飼喂卡拉庫爾羊，能顯著增加其體重［5］。

金黃色葡萄球菌（S.aureus）是典型的革蘭氏陽性病原體，廣泛分布于自然界［6］。金黃色葡萄球菌是葡萄球菌屬成員之一，最早是在一位病人潰瘍的膿瘡中發(fā)現(xiàn)，其引起的疾病表現(xiàn)出高發(fā)病率及高死亡率，金黃色葡萄球菌所帶來的危害僅次于大腸埃希菌（E.coli）［7］。它可引起多種人類疾病，如骨髓炎、心內(nèi)膜炎、毛囊炎、敗血癥、壞死性肺炎、膿毒血癥等全身性感染，甚至機體死亡［8］?？股啬退幮砸鸾瘘S色葡萄球菌耐藥性經(jīng)常發(fā)生，在抗菌譜分析中，鹽穗木提取物對枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和金黃色葡萄球菌抑菌作用明顯［9］，鹽穗木的乙酸乙酯、正丁醇提取物具有明顯的抗菌活性。

研究鹽穗木正丁醇萃取物單體對金黃色葡萄球菌細胞壁結(jié)構(gòu)完整性的影響，有助于揭示鹽穗木的抑菌機理。鹽穗木的研究領(lǐng)域涉及生態(tài)學(xué)、藥物化學(xué)及抑菌作用等方面，抑菌機理研究較少，為解決細菌耐藥性，試驗研究了鹽穗木正丁醇萃取物的抑菌機理，對促進南疆經(jīng)濟發(fā)展具有實際意義［10］，為合理開發(fā)鹽穗木飼料及新植物資源和新獸藥的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

金黃色葡萄球菌是人類和家畜感染的主要致病菌之一［11］。細菌耐藥性已成為臨床醫(yī)藥上比較棘手的問題，所以，用于治療金黃色葡萄球菌感染的新型藥物缺乏問題急待解決。前期試驗選擇了多種植物進行抑菌試驗，結(jié)果表明，鹽穗木對金黃色葡萄球菌抑菌效果明顯，抑菌效果強于黃連素，對大腸桿菌也有明顯的抑菌作用。故以鹽穗木為研究材料，分離活性單體，篩選抑菌有效成分，測定其抑菌譜和抑菌效價，為鹽穗木的綜合利用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 原料

新疆阿拉爾市周邊地區(qū)采集鹽穗木，采用隨機取樣法取地面部分的莖、葉或子實等，自然陰干，粉碎備用。

1.2 試劑

甲醇、無水乙醇、氯仿、75%乙醇、正丁醇、氫氧化鈉、乙酸乙酯、蒸餾水、鹽酸、柱層析硅膠，其他試劑為常規(guī)分析純試劑。

1.3 儀器

N-1300D-WB 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；KQ-500DE 型高功率數(shù)控超聲波清洗儀；紫外分光光度計；氣相-質(zhì)譜聯(lián)用儀；SW-CJ-2FD 超凈工作臺（BAOXUN）；電子天平（梅特勒托利多有限公司）；高壓滅菌鍋（HI?RAYAMA）；THZ-82A 水平搖床（金壇市醫(yī)療儀器廠）；DHG-9245A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱；HPX-9052MBE 數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱；HH-S4 數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇金怡儀器科技有限公司）；SHZ-D（III）循環(huán)水式多用真空泵；高速萬能粉碎機；恒溫培養(yǎng)振蕩器。

1.4 培養(yǎng)基

1.4.1 固體培養(yǎng)基 Mueller-Hinton 瓊脂（g/L）：牛肉浸粉6.0，可溶性淀粉1.5，酸水解酪蛋白17.5，瓊脂17.0，pH 7.3±0.1，冷卻至25 ℃。

1.4.2 鹽穗木培養(yǎng)基 稱鹽穗木粉末42.0 g，加熱后溶解于1 000 mL 蒸餾水中，121 ℃高壓滅菌15 min，待冷至50 ℃時，傾入無菌平皿，備用。

1.5 方法

1.5.1 正丁醇萃取物的提取 自然風(fēng)干的鹽穗木用中藥粉碎機（型號FW177，粉碎目數(shù)60～200 目，轉(zhuǎn)速24 000 r/min）粉碎，取鹽穗木粉碎樣品400 g 于廣口瓶中。加入75%的乙醇浸泡6～7 h，后用KQ-500DE 型超聲波清洗器處理60 min（水溫38～40 ℃，水位92 mm，功率100%），趁熱抽濾，收集濾液，蒸出的乙醇浸泡過濾留下的鹽穗木，減壓回收得乙醇浸膏提取物。乙醇浸膏加適量2%鹽水攪拌溶解，過濾除去難溶性物質(zhì)，再加NaOH 調(diào)節(jié)pH 9~10（堿性），過濾于分液漏斗，加上500 mL 氯仿，混勻靜置分層（一般15～20 min），分層液體的上面是蒸餾水，下面是氯仿液，將氯仿液倒入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)（60 ℃），回收氯仿進行萃取，至氯仿萃取液無色即為氯仿萃取物。依次加入氯仿、乙酸乙酯、正丁醇進行萃取。

1.5.2 正丁醇萃取物單體的提取 取適量正丁醇萃取物于蒸發(fā)皿并加5 mL 甲醇溶解，然后加10 g 硅膠混勻完全溶解，置于恒溫水浴鍋上至完全烘干得到正丁醇萃取物硅膠顆粒。硅膠用洗脫機充分溶解裝柱至層析柱的2/3。洗脫劑用甲醇、氯仿、乙酸乙酯以1∶2∶1 比例配置。干法上樣，錐形瓶接出濾液，控制洗脫劑的流速，不宜太快，控制在5 mL/min，收集萃取液，直至無色為止，每瓶100 mL，濾液減壓回收編號待用。收集萃取液用小型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)，將各個收集液濃縮至5 mL 小瓶中，蒸干后的物質(zhì)備用。各個萃取物按此方法重復(fù)多次，即可得到正丁醇萃取物的單體。

1.5.3 正丁醇萃取物單體MBC 和MIC 的測定 取鹽穗木的正丁醇萃取物單體，用蒸餾水溶解膏體，配成250 mg/mL 的正丁醇萃取物溶液。用倍比稀釋法制成250 、125、62.5 、31.25 、15.6 、7.8、0 mg/mL。分別吸取1 mL 至7 支試管中，分別加入970 μL 培養(yǎng)液和30 μL 106CFU/mLS.aureus菌液，使1～7 號試管中藥液的終濃度分別為125.00、62.50、31.25、15.60、7.80、3.90、0 mg/mL。于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16~24 h，均勻涂布接種于固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)16～24 h后觀察結(jié)果。以菌落數(shù)出現(xiàn)最少的最大萃取物濃度為最低抑菌濃度（MIC），以無菌落生長的最小萃取物濃度為最低殺菌濃度（MBC）［12］。

1.5.4 紙片法評價正丁醇萃取物單體的抑菌效果鹽穗木單體藥物濃度為125.00、62.50、31.25、15.60、7.80、3.90、0 mg/mL，采用紙片法做藥敏試驗。根據(jù)抑菌圈直徑的大小來判斷S.aureus對藥液敏感程度，判斷標準如下［13，14］。抑菌圈直徑≥20 mm 為極敏；15 mm≤抑菌圈直徑<20 mm 為高敏；10 mm≤抑菌圈直徑＜15 mm 為中敏；5 mm≤抑菌圈直徑＜10 mm 為低敏；抑菌圈直徑＜5 mm 表示呈耐藥，無抑菌效果。

1.5.5 正丁醇萃取物單體的結(jié)構(gòu)鑒定 GC-MS 色譜柱AB-5MS 5% Phe-nyL-95% Dimethylpolysilox?ane。（30 m×0.25 mm×0.25 mm）彈性毛細管柱；柱溫60 ℃，10.5 ℃/min 升溫至300 ℃，保留5 min；汽化差溫度250 ℃；載氣為高純He（99.999%）；柱前壓52.54 kPa、載氣洗量1.0 mL/min；分流比20∶1，溶劑延遲3 min。

離子源為EI 源，離子源230 ℃，四級桿150 ℃，電子能量70 eV，發(fā)射電源流34.6 μA；倍增器電壓1 125 V；接口溫度280 ℃；質(zhì)量范圍20～450 amu。

Nist2005 和Wiley275 譜序檢查。

2 結(jié)果與分析

2.1 正丁醇萃取物的抑菌效果

如表1 所示，1 號、2 號、3 號紙片法藥敏試驗的抑菌圈直徑分別為18.0、15.4、14.3 mm，敏感度分別為高敏、高敏、中敏，4 號為低敏。

表1 紙片法評價正丁醇萃取物單體抑菌效果

2.2 正丁醇萃取物單體的MIC 和MBC

如表2 所示，鹽穗木正丁醇萃取物單體具有顯著的抑菌特性，隨著單體藥物濃度增大，抑菌圈也越來越大，表明抑菌效果更好。5~7 號培養(yǎng)基細菌生長較好，金黃色葡萄球菌對該濃度表現(xiàn)為耐藥性。4號培養(yǎng)基有少數(shù)金黃色葡萄球菌，1~3 號培養(yǎng)基均無金黃色葡萄球菌生長。4 號為菌落數(shù)出現(xiàn)最少的最大萃取物濃度，為最低抑菌濃度（MIC），為15.60 mg/mL。3 號為無菌落生長的最小萃取物濃度，為最低殺菌濃度（MBC），為31.25 mg/mL。

表2 正丁醇萃取物單體的抑菌效果

2.3 鹽穗木正丁醇萃取物單體結(jié)構(gòu)

經(jīng)鑒定，鹽穗木正丁醇萃取物單體為N-氰基-乙基苯磺酰胺（N-（2-Cyano-ethyl）-benzenesulfon?amide），分子式為C9H10N2O2S，結(jié)構(gòu)式如圖1 所示。

圖1 鹽穗木正丁醇萃取物單體結(jié)構(gòu)式

3 小結(jié)

鹽穗木正丁醇生物堿萃取物成分種類較多，其抑菌性差別較大。本試驗旨在摸索鹽穗木正丁醇生物堿抑菌效果最好的單體成分。前期試驗表明，鹽穗木的提取條件、萃取條件均會影響單體成分的產(chǎn)量，因單體成分總重量少，在試驗過程中存在較大的偶然誤差。

鹽穗木正丁醇萃取物對金黃色葡萄球菌有一定的抑菌作用，主要抑菌物質(zhì)是N-氰基-乙基苯磺酰胺，其最低抑菌濃度15.60 mg/mL，最小殺菌濃度31.25 mg/mL。