基于文獻挖掘和網絡藥理探討中藥治療DPN用藥規律和作用機制

邢琪昌 陳 佳 劉 征 李 偉 劉 湘

湖南省湘潭市中心醫院藥學部，湖南湘潭 411100

糖尿病周圍神經病變（diabetic peripheral neuropathy，DPN）是一種糖尿病引起的神經功能障礙相關疾病，臨床癥狀包括疼痛、麻木、蟲爬、發熱等，多發于下肢，是引起糖尿病足甚至截肢的危險因素[1-2]。《王旭高醫案》中云：“消渴日久，但見手足麻木，肢涼如冰，四肢痿弱乏力”，描述的消渴痹癥的臨床表現與DPN 屬同一范疇[3]。本研究通過收集當代中醫治療DPN 的內服方藥，分析其用藥規律，并對核心藥對的作用機制進行網絡藥理學分析預測，以期為臨床治療DPN 提供思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料

以“糖尿病周圍神經病變”“DPN”“消渴痹癥”“痹證”“絡病”等為關鍵詞，檢索中國知網（China National Knowledge Infrastructure，CNKI）2009 年1 月1 日 至2020 年9 月30 日相關文獻，搜集論述完整、方劑處方清晰、遵循中醫辨證思想、具有臨床療效的中藥內服治療DPN 的臨床報道。

1.2 研究方法

1.2.1 數據規范 根據《中藥大辭典》[4]和《中藥學》[5]（十二五教材）處方中中藥名進行統一規范整理，例如把枸杞子統計為枸杞，土元統計為土鱉蟲等。將收集好的437 首處方藥物依次錄入Excel 模版，建立數據庫。

1.2.2 數據分析 ①使用中醫傳承輔助系統（V3.0）軟件進行統計分析，分別統計分析藥物使用頻次、藥物功效及組方規律，獲得核心藥對；②通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）數據庫檢索核心藥對的所有化學成分，并對應作用靶點；③在DrugBank、TTD 和DisGeNET 數據庫中檢索收集DPN 相關疾病靶點；④將上述藥物靶點與疾病靶點取交集，作為核心藥對干預DPN 的作用靶點；⑤將上述作用靶點上傳至DAVID 數據庫，進行KEGG 和GO 富集分析。方法步驟參考文獻[6-7]。

1.2.3 分子對接驗證 從Pubchem 數據庫下載化合物3D 結構（SDF 格式文件），從PDB 數據庫下載靶點蛋白的3D 結構（pdb 格式文件），使用PyMOL 軟件對化合物和蛋白進行去水、加氫處理，然后通過AutoDock VINA 1.1.2（No registration required）軟件將化合物與靶蛋白進行對接，計算結合能，并展示結合構型，步驟參考文獻[8-9]。

2 結果

2.1 數據挖掘結果

2.1.1 藥物功效統計分析 在干預DPN 的437 首中藥方劑中共應用中藥204 味，出現頻次共4550 次。應用最多的依次為補虛類、活血化瘀類和解表類等中藥。見圖1。

2.1.2 基于關聯規則的藥物組合使用統計分析 組方用藥規律以規則分析為核心處理算法，設置支持個數為100（表示所有藥物中同時出現的個數），置信度0.7，點擊“用藥模式”，展示前15 組支持度較高藥對，其中黃芪-當歸組合支持度最高，故將其選為核心藥對，用于網絡藥理學分析。見圖2。

2.2 網絡藥理分析結果

2.2.1 核心藥對成分靶點圖構建 檢索獲得黃芪-當歸中212 個化合物對應作用244 個靶點，并收集DPN 相關靶點148 個，兩者取交集，獲得黃芪-當歸干預DPN 作用靶點33 個，Degree 值較高的化合物分別為MOL00 0098（槲皮素）、MOL000206（異丁香酚）等。見圖3。

2.2.2 蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡構建及KEGG 通路富集分析 將上述33 個共同靶點基因輸入至STRING 數據庫獲得PPI 圖（圖4），Degree 值較高的靶點有SLC6A4、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）等；KEGG 與GO 富集分析結果見圖5～6，通路主要有神經活性配體受體交互作用、鈣離子信號通路等，GO 分析富集得到140 個生物過程，包含刺激反應、生物調節等，18 個細胞組成包括細胞膜、內膜系統等，以及25 個細胞功能包括蛋白結合、分子傳導活性等。

2.3 分子對接驗證

選擇“2.2.1”結果中成分作為核心成分；選取IL-6和SLC6A4 作為分子對接的靶點蛋白。分子對接結果顯示核心成分與關鍵靶點的結合能均＜-5.0 kcal/mol，具有較好的親和力和結合活性。見表1。

表1 分子對接實驗結果

3 討論

DPN 是一種最為常見的糖尿病并發癥，約有50%以上1型或2型糖尿病患者患有DPN[10]。目前西醫對DPN 的治療除了控制血糖外，還包括抗氧化應激、改善代謝紊亂、改善微循環等對癥治療[11]。但DPN 致病因素復雜，復發率高，仍需積極尋找針對治療DPN 的新手段和新藥物。

中醫藥治療“消渴痹癥”“絡病”“痹癥”等疾病歷史悠久，近現代亦有豐富的文獻記載。本研究通過對近10 年當代中醫運用中藥方劑內服治療DPN 的文獻進行收集整理，發現補虛類藥物應用最多，其次是活血化瘀藥，體現中醫治療DPN 扶正祛邪的基本原則。黃芪和當歸分別為補氣與補血活血的要藥。研究顯示，黃芪在降血脂、降血糖和減少糖尿病并發癥等方面具有獨特優勢[12-13]。當歸藥理作用主要體現在促進造血細胞分化和增殖及抑制微炎癥[14]，但也有研究顯示當歸中某些成分能夠上調神經生長因子，從而達到保護神經的作用[15]。

中醫藥治療疾病作用機制常常難以闡釋。本研究通過網絡藥理學方法對高頻核心藥對黃芪-當歸的潛在作用機制進行預測。化合物篩選方面，槲皮素和異丁香酚在神經保護方面具有重要作用。槲皮素是一種常見的黃酮類化合物，具有強抗氧化和清除自由基作用[16]。Xie 等[17]研究顯示槲皮素能夠改善STZ 誘導的DPN 大鼠周圍神經損傷，其機制與調節DPN 表型相關的腸道菌群和活性氧表達水平有關。也有體外研究顯示，槲皮素可以通過增加自噬以促進RSC96 細胞的增殖、減少凋亡，從而減輕高濃葡萄糖的損傷[18]。異丁香酚屬于當歸揮發油中主要成分之一，有報道稱其對丙烯酰胺誘導的大鼠神經病變具有保護作用，機制與減弱坐骨神經區域氧化應激標志物和谷胱甘肽水平有關[19]。IL-6 參與IL-17 和TNF 等炎癥通路和糖基化終末產物-受體信號通路，這些靶點和通路在DPN 的發生發展中都扮演了重要角色[20]，有研究顯示，IL-6水平升高與痛性DPN 的發生相關[21-22]，SLC6A4 是一種5-羥色胺轉運蛋白，存在于神經突出前膜，將突觸間隙5-羥色胺回吸收至突觸前神經元囊泡，調節突觸間隙5-羥色胺數量，進而影響突觸后膜5-羥色胺受體活性及突觸間信息傳遞，從而參與疼痛調節[23]，SLC6A4基因多態性與慢性疼痛綜合征患者疼痛敏感性的個體差異有關[24-25]。

綜上所述，中醫藥在DPN 治療中應用廣泛，本研究通過數據挖掘和網絡藥理學方法系統剖析了當代醫家采用中醫藥治療DPN 的用藥規律及其核心藥物潛在的作用機制，為后期中藥抗DPN 機制研究奠定基礎。