基于多元統計分析的不同半夏種質資源中5種成分含量的比較研究

劉建橋，朱曉花，李三要※，管秋山，李燕驕，江世高，劉海華

（1.湖南省邵陽市草地資源保護中心/邵陽市南方草業科學研究所，湖南 邵陽 422000；2.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208）

半夏（Pinellia ternate）為多年生草本植物，塊莖入藥，已有2 000多年的藥用歷史。半夏為天南星科植物，具有燥濕化痰、降逆止嘔的功能[1]。半夏喜陰涼濕潤環境，多生于山坡、溪邊陰濕的草叢或疏林[2]。

現代研究表明半夏的主要化學成分有有機酸類、生物堿、揮發油類、凝聚素、脂肪酸、腦苷脂、黃酮類、甾醇類、氨基酸、半夏蛋白和無機元素以及苯丙素類等[3-5]。半夏的生物堿含量很低，但被認為是具有藥理作用的主要成分之一，半夏生物堿的主要成分為L-麻黃堿、葫蘆巴堿、膽堿、鳥苷、胸苷、肌苷、尿苷和腺苷等[6]。核苷類成分是細胞維持生命活動的基本組成元素，具有改善人類健康和預防疾病的作用[7]。

主成分分析通過降維處理來達到簡化原始數據指標的目的[8]。PLS-DA是一種無監督的模型識別方法，可尋找引起樣品之間差異的變量[9]。聚類熱圖可從橫向和縱向兩個方面聚類反映樣品的關系，還通過熱圖顏色的深淺來反映樣品中相應成分含量大小[10]?；疑P聯度分析和TOPSIS模型分析在中藥材資源的質量綜合評價方面運用廣泛，多元統計分析可實現對中藥質量更準確、更全面的分析。

因此，本實驗以琥珀酸、鹽酸麻黃堿、尿苷、鳥苷和腺苷為指標成分，建立同時測定半夏中5個成分的HPLC法，通過多元統計分析對14批不同產地半夏進行研究和評價，以期為半夏的質量控制提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

儀器：Agilent1200高效液相色譜儀（配備紫外分光檢測器）；Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18（250 mm 4.6 mm，5m）色譜柱；數顯恒溫水浴鍋HH-8；萬分之一電子天平CP224S；DHG-91012A型電熱恒溫鼓風干燥器；高速多功能粉碎機BJ-100型；紫外分光光度計UV-180；KQ-100TDE超聲波清洗器；himac CF 16RX離心機；0.22m PALL進口濾頭，0.45m津騰有機濾膜、水系濾膜和泰寧一次性注射器。

1.2 材料

甲醇、磷酸均為色譜純，磷酸二氫鉀為分析純；琥珀酸（批號：Z18D6H7816）；鹽酸麻黃堿（批號：171241-201508）；尿苷（批號：TM0313XA13）；鳥苷（批號：111977-201501）；腺苷（批號：KM0529CA14）對照品均購于源葉生物公司。14批半夏樣品來源信息見表1，經邵陽市草地資源保護中心李三要研究員鑒定為天南星科植物半夏Pinellia ternata(Thunb.)Breit.的干燥塊莖。

表1 半夏樣品信息Table 1 The information of thesample

表1 半夏樣品信息Table 1 The information of thesample

編號Number來源Source生長狀態Growth state編號Number來源Source生長狀態Growth state X1 貴州威寧 栽培 X8 甘肅隴南 栽培X2 重慶豐都 栽培 X9 四川南充 野生X3 湖南張家界 野生 X10 四川遂寧 栽培X4 湖北襄陽 野生 X11 山西長治 栽培X5 河北安國 栽培 X12 山東臨沂 野生X6 河北保定 栽培 X13 山東臨沂 栽培X7 安徽滁州 栽培 X14 山東菏澤 栽培

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Zorbax Eclipse XDB-C1（8 250 mm 4.6 mm，5m）色譜柱；流動相：0.01 mol/L KH2PO（4 A）-甲醇（B），柱溫：30℃；進樣量20L，流速：1.0 mL/min，紫外檢測波長：210 nm；在張嚴方的方法基礎上加以改進[11]，梯度洗脫為（0～5 min，12%B；5～15 min，12%～35%B；15～20 min，35%～100%B）。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 分別稱取琥珀酸、鹽酸麻黃堿、尿苷、鳥苷和腺苷標準品30 mg、10 mg、20 mg、24 mg和16 mg，用超純水溶解并定容至25 mL容量瓶中，搖勻，分別取2 mL制成濃度依次為240g/mL、80g/mL、160g/mL、192g/mL和128g/mL的混合標準液，作為儲備母液，放4℃冰箱備用。

2.2.2 樣品制備 將烘干的的半夏塊莖樣品打磨成粉后，取1.0 g半夏塊莖粉末用10 mL超純水超聲提取2 h，5 000 r/min離心10 min，取其上清液，重復1次，后定容至25 mL容量瓶，備用，設置3個重復。

2.3 系統適應性

按2.1項色譜條件下，半夏5種化學成分分離很好，出峰時間適宜，靈敏度高，信噪比和理論塔板數均符合定量要求，色譜圖見圖1（標準品）和圖2（樣品），圖中標號1-5分別代表琥珀酸、腺苷、尿苷、鳥苷和鹽酸麻黃堿。

圖1 標準品混標色譜圖Fig.1 The chromatogram of the mixed standard

圖2 半夏樣品色譜圖Fig.2 The chromatogram of the sample

2.4 方法學考察

2.4.1 線性關系考察 將母液用超純水逐步稀釋制成1/2、1/4、1/8、1/16倍于混合母液的混合標品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行測定，以質量濃度作x軸，峰面積作y軸，繪制標準曲線，見表2。

表2 線性回歸方程Table 2 Linear regression equation

2.4.2 穩定性試驗 對同一份半夏樣品在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h和12 h這7個時間點上樣檢測，結果（表3）表明半夏琥珀酸、腺苷、尿苷、鳥苷和鹽酸麻黃堿這5個成分保留時間RSD（t）和峰面積RSD（a）分別為0.23%～0.71%、1.11%～1.22%，均符合穩定性要求，表明半夏樣品溶液在12 h內穩定性良好。

2.4.3 精密度試驗 精密吸取半夏樣品提取液，連續進樣5次，結果（表3）表明半夏5種化學成分的保留時間RSD（t）為0.03%～0.10%，5種化學成分的峰面積RSD（a）為0.21%～0.62%，表明儀器精密度良好。

2.4.4 重復性試驗 取半夏同一批次半夏樣品5份，按照2.2.2項方法處理半夏樣品后，上樣檢測，結果（表3）顯示5種化學成分的保留時間RSD（t）為1.05%～2.11%，5種化學成分的峰面積RSD（a）為0.11%～1.27%，表明該方法重復性好。

2.4.5 加樣回收率試驗 精密稱取半夏樣品1.0 g，對已測得5種成分含量的同一批半夏供試品5份，分別精密加入一定量的各對照品母液，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，計算各成分加樣回收率，結果（表3）顯示加樣平均回收率在87.12%～95.43%，其RSD值為0.22%～2.21%，均符合要求，回收率優良。

表3 方法學考察Table 3 The methodology verification

2.4.6 樣品測定 取14批半夏樣品溶液，按“2.1”項色譜條件進行檢測，重復3次，計算樣品中5種成分含量，分析結果見表4。

2.5 差異顯著性分析

半夏5種成分含量測定結果見表4。從表4中可知半夏中琥珀酸含量為6.33～11.74 mg/g，鹽酸麻黃堿含量為0.403～0.910 mg/g，尿苷含量為0.578～0.824 mg/g，鳥苷含量為0.333～0.919 mg/g，腺苷含量為0.072～0.186 mg/g。

表4 各成分含有量測定結果（mg/g）Table 4 Results of the content determination of various constituents(mg/g)

對14個不同產地半夏5種成分進行單因素方差分析Tukey HSD檢驗，從圖3～圖7中可以看出，5種成分含量差異均有極顯著差異，其中X12地區的半夏琥珀酸含量極顯著高于其他地區的半夏琥珀酸含量；X4-X11這7個地區的鹽酸麻黃堿含量相對較高，是X1-X3這3個地區半夏鹽酸麻黃堿含量的近2倍；X9地區的半夏尿苷含量最高，極顯著高于其他地區的半夏尿苷含量；X6地區的半夏鳥苷含量最高，極顯著高于其他地區的半夏尿苷含量；X3、X10-X13這5個地區的半夏腺苷含量相對較高。

圖3 不同居群半夏琥珀酸含量差異Fig.3 Differences in succinic acid content of in different populations

圖4 不同居群半夏鹽酸麻黃堿含量差異Fig.4 Differences in the content of ephedrine hydrochloride in from different populations

圖7 不同居群半夏腺苷含量差異Fig.7 Differences in adenosine content ofin different populations

圖5 不同居群半夏尿苷含量差異Fig.5 Differences in the content of uridine in different populations

圖6 不同居群半夏鳥甘含量差異Fig.6 Differences in guanosine content ofin different populations

2.6 灰色關聯度與TOPSIS模型分析

灰色關聯度與TOPSIS模型分析適合用于中藥材質量的綜合評價，灰色關聯度可充分利用原始數據尋找整體上的規律性，TOPSIS法具有評估合理、應用靈活等優點[12,13]。參考孟杰等[12]對14個產地半夏的5種成分進行兩種綜合分析對比，從表5可知，兩種不同參評方法的總體排序趨勢基本一致，灰色關聯度和DTOPSIS法的最大關聯度差異分別為51.10%和99.24%，說明不同地區的半夏質量差異十分明顯，而DTOPSIS法分析的最大關聯度差異超過了95%，由此可以看出此處DTOPSIS法綜合評價效果更好。對不同地區半夏品質綜合評價的DTOPSIS法分析結果Ci排序為X12＞X14＞X13＞X1＞X6＞X8＞X11＞X7＞X2＞X5＞X10＞X4＞X3＞X9，對比兩個排序，半夏質量最好的是X12，半夏質量最差的兩個是X9和X3。

表5 不同產地樣品灰色關聯度和CiTable 5 Grey correlations and Ci of samples from different growing areas

2.7 主成分分析

主成分析方法（PCA）是一種監督模識別方法，可直觀地從多維空間上表現不同樣品間的成分差異。將14個不同居群半夏的5種成分構成一個整體txt數據集，采用主成分分析方法，提取前3個主成分，并繪制各樣本的主成分得分圖，從圖8可知，不同居群半夏的PCA模型中84.6%變量被用來塑造3D模型的主要成分，PC1、PC2和PC3分別為43.3%、26.8%和14.5%，從PCA得分圖中看到不同居群半夏有明顯的品質區別，并各自聚集成群，可將不同地區的半夏樣本明顯區分成4個類別，X11、X12和X13聚為一類，X4、X7、X8、X9、X10和X14聚為一類，X6、X5聚為一類，X1、X2和X3聚為一類，反映出各個產地半夏的質量信息情況。

圖8 樣品主成分得分圖（14 5數據集）Fig.8 The score plot of principal component analysis based on 14 5 data set

2.8 偏最小二乘判別分析

為了進一步發掘不同居群半夏樣品成分的輪廓特征，采用偏最小二乘判別分析法（PLS-DA）進行考察，該方法可以同時對數據集進行分類和特征提取。如下圖9所示，在PLS-DA得分圖上合計表征了原始變量65.4%的信息，主成分1為38.9%，主成分2為26.5%，從圖中可以看出不同居群半夏樣品位置分布較散，X8、X11、X12、X13和X14聚為一類，X9、X10聚為一類，X1、X3、X4、X6和X7聚為一類，X2、X5聚為一類，說明5種成分對不同居群半夏樣本的分類起了關鍵作用。

圖9 PLS-DA得分圖Fig.9 The loading plot of PLS-DA

2.9 聚類分析熱圖

通過在MetaAnalyst軟件中以平方Euclidean距離為度量標準，使用組間聯接法繪制半夏14個樣品的系統聚類樹狀圖和熱力圖（圖10），以直觀展示各成分在不同居群半夏中的含量差異，各居群半夏樣本的聚類分析顯示，可將不同居群半夏劃分為4個種類，X12、X11、X13、X10和X14聚為一類，X3、X1、和X2聚為一類，X4、X7和X8聚為一類、X9、X5和X6聚為一類。5種成分的聚類結果顯示可以明顯分為2個類群。類群（1）為琥珀酸和鹽酸麻黃堿，類群（2）為尿苷、鳥苷和腺苷。熱圖顏色深淺可以代表含量的高低，從熱圖可以明顯的看出X12顏色最深，X6、X14和X10顏色較深，琥珀酸中顏色最深的為X12，尿苷中顏色最深的為X9，即熱圖可以直觀地體現不同樣品各成分的差異。

圖10 不同居群半夏的聚類分析及含量熱圖Fig.10 The cluster analysis and content heat map ofin different populations

3 討論

3.1 提取工藝的選擇

試驗前期分別將甲醇、純水和不同比例的甲醇-水作為提取溶劑進行超聲提取，結果發現用純水提取效率最高。對比提取時間（30 min、60 min和90 min）的效果，發現60 min和90 min的提取效率差異不顯著，但均優于30 min，故選擇60 min提取。

3.2 色譜條件的優化

比較了水-甲醇、水-乙腈、KH2PO4-甲醇、KH2PO4-乙腈等不同流動相對色譜峰的影響，發現KH2PO4-甲醇梯度洗脫的分離效果最佳，且能在12 min內實現分離測定，時間遠低于前人的研究[2,14]，大幅度節約了分析成本，優化后的HPLC法簡便快捷，可同時測定半夏琥珀酸、鹽酸麻黃堿、尿苷、鳥苷和腺苷5種重要成分，可用來對大批量的半夏種質資源進行質量評價。

3.3 成分測定結果分析

用SPSS軟件進行單因素方差分析，發現生長環境的不同對半夏中5種成分含量影響極顯著，用MetaboAnalyst5.0軟件進行PCA、PLS-DA和聚類熱圖分析，14批半夏樣品均可聚為4類，用Excel 2010軟件對數據進行灰色關聯度分析和TOPSIS模型分析，發現山東臨沂野生品種（X12）的綜合得分最高，而其他3種野生品種X3、X4和X9綜合評分較低；無論從單一成分還是整體來看，野生品種和栽培品種的5種含量差異沒有表現明顯差異性，說明半夏這5種成分含量與野生還是栽培無明顯相關性；研究還發現綜合評分較高的X12、X13、X14、X6和X8均為北方地區所產的半夏，這可能與南北地區的氣候條件、降水差異存在較大的關系，后續會進行更深的一步試驗來驗證。

本研究建立的一測多評法可在12 min內同時測定半夏中琥珀酸、鹽酸麻黃堿、尿苷、鳥苷和腺苷5種成分的含量，運用多元統計分析對半夏樣品進行綜合評價，主成分分析、偏最小二乘判別分析和聚類分析，結果顯示，14組半夏樣品均可分為4大類，但3種分析的4大類有一定區別，且主成分分析、偏最小二乘判別分析的主成分綜合得分不能較好的體現出樣品質量的優異性，故在單因素方差分析基礎上，采用灰色關聯度與TOPSIS模型分析來計算半夏各樣品的綜合得分，可以明顯的顯示出各個產地半夏樣品的質量差異。

綜上所述，本研究建立的一測多評法可同時測定半夏中5種活性成分的含量，這對半夏質量更準確全面的控制提供了參考依據；在對半夏種質資源進行質量評價時，建議采用單因素方差分析和TOPSIS模型分析，即可體現出半夏的單個成分含量高低和樣品的總體質量水平。