基于網絡藥理學探討安化黑茶延緩動脈粥樣硬化的分子機制研究

王華，劉柏炎，陳博威，湯艷

（1.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學，湖南 長沙 410208；

3.益陽醫(yī)學高等專科學校，湖南 益陽 413000）

關鍵字：安化黑茶；動脈粥樣硬化；網絡藥理學；分子機制

隨著經濟快速發(fā)展，人們的生活方式以及飲食結構也隨之改變，導致動脈粥樣硬化的發(fā)病率呈持續(xù)上升趨勢[1]。動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展較隱匿，病變的早期沒有臨床癥狀且難以檢測。因此，尋找一種藥食同源的食物防微杜漸，從源頭上延緩動脈粥樣硬化顯得十分重要。安化黑茶作為一種健康飲料，主要來源植物為山茶科（Theaceae）山茶屬（Camellia）茶組植物[Camellia sinensis(L.)O.Kuntze][2,3]，具有良好的保健功效。課題組前期研究發(fā)現，安化黑茶可通過降血脂，抑制氧化應激，發(fā)揮延緩動脈粥樣硬化的作用[4,5]。然而以往的研究都是針對單一靶點及單一通路，無法系統(tǒng)闡明安化黑茶延緩動脈粥樣硬化的分子機制。網絡藥理學整合了系統(tǒng)生物學的思想，通過對“藥物 靶點網絡

疾病”之間的網絡分析，廣泛地應用于天然產物藥效物質基礎的篩選及其作用機制的研究中[6]。因此基于前期認識，本研究擬通過網絡藥理學方法，系統(tǒng)探究安化黑茶延緩動脈粥樣硬化的藥效物質基礎及相應的分子機制，并進行初步實驗驗證，以期為其新藥開發(fā)和基礎研究提供新思路。

1 資料與方法

1.1 安化黑茶中活性成分篩選與作用靶點預測

本研究通過中國知網（https://www.cnki.net）及Pub-Med數據庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed）檢索安化黑茶活性成分[3,7,8]。隨后將各活性成分導入至中藥系統(tǒng)藥理學數據庫（TCMSP,http://tcmspw.com/tcmsp.php）及STITCH數據庫（http://stitch.embl.de/），查詢其潛在作用靶點，最后將靶點導入Uniprot數據庫（http://www.uniprot.org），限定物種為“human”，獲取靶點官方基因名。

1.2 動脈粥樣硬化相關靶點的獲取

本研究以“atherosclerosis”為關鍵詞，分別檢索人類基因數據庫（Gene Cards,https://www.genecards.org）和比較毒物基因組學數據庫（CTD,http://ctdbase.org），合并且刪除重復靶點后，構建疾病靶標庫。

1.3 活性成分 靶點網絡及蛋白互作網絡的構建

通過jvenn在線工具，將安化黑茶的預測靶點與動脈粥樣硬化的預測靶點取交集，獲取疾病 藥物關鍵作用基因。運用Cytoscape 3.71軟件創(chuàng)建活性成分靶點網絡圖，并借助String數據庫，將物種設定為“homo sapiens”，最低互作得分設置為0.7，得到蛋白互作（protein-protein interaction,PPI）網絡圖。

1.4 核心作用基因的富集分析

運用R語言“Biomanager”、“ClusterProfiler”等軟件包，將得到的靶點基因進行基因本體（gene ontology,GO）分析及京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）通路富集分析。

1.5 成分 靶點 通路網絡圖的構建

將主要KEGG通路富集結果與活性成分-靶點網絡圖進行匯總，運用Cytoscape 3.71軟件構建成分-靶點-通路網絡圖。

1.6 動物實驗驗證

1.6.1 實驗動物 60只雄性SD大鼠，SPF級，體質量（200±20）g，購自湖南斯萊克景達有限公司，動物生產許可證號：SCXK（湘）2019-0004。于湖南中醫(yī)藥大學實驗動物中心飼養(yǎng)，動物使用許可證號：SYXK（湘）2019-0009，實驗過程中對大鼠的處置均符合湖南中醫(yī)藥大學倫理委員會善待動物的倫理學要求。

1.6.2 主要藥品與試劑 安化黑茶品種為2014年天茯茶[9]（生產批號：GB/T9833.3-2002，規(guī)格：1 kg）、阿托伐他汀鈣膠囊（河南天方藥業(yè)，批號：H20070054，規(guī)格：20 mg）、Rat IL-6 ELISA Kit（武漢博士德公司，EK0412）、Rat TNF alpha ELISAKit（武漢博士德公司，EK0526）。安化黑茶水煎劑制備方法[9]：將安化黑茶按每克茶葉加12 mL沸水，武火煮至沸騰后改文火，繼續(xù)煎煮20 min，冷卻后倒出茶水另置。第2次加水量為每克茶葉加8 mL沸水，煎煮同前。將2次茶水混合并4 000 r/min（4℃）離心15 min后，取上清液濃縮為含生藥量為0.5 mg/mL的藥液，其后放置在4℃冰箱中，冷藏備用。

1.6.3 造模與分組 大鼠適應性喂養(yǎng)1周后，隨機分為正常組10只、造模組50只。正常組給予普通飼料，造模組給予自制高脂飼料（按參考文獻[10]配制），自由飲食飲水，連續(xù)喂養(yǎng)12周。同時，造模各組在造模前先腹腔注射VitD3 60萬IU/kg，造模后的第3周、第6周和第9周各自補充VitD310萬IU/kg，建立動脈粥樣硬化大鼠模型。喂養(yǎng)12周后，根據大鼠體質量及血清血脂水平驗證模型是否建立成功，隨后將造模成功的模型大鼠隨機分為模型組、阿托伐他汀組和黑茶高、中、低劑量組，每組10只。

1.6.4 給藥方法 阿托伐他汀組每日給藥量為10 mg/kg，各安化黑茶組根據成人每天推薦飲用量10 g[11]，按照成人體質量60 kg換算，安化黑茶高、中、低劑量組每日給黑茶（生藥）量分別為2.03 mg/kg、1.015 mg/kg、0.507 5 mg/kg，正常組、模型組給同等體積蒸餾水灌胃。每天灌胃1次，連續(xù)4周。處死大鼠前禁食12 h，水合氯醛麻醉后進行腹主動脈采血并收集主動脈組織。

1.6.5 HE染色 將浸泡在4%多聚甲醛中的心底及主動脈組織取出，脫水，透明并包埋。切片，厚度約為4m，將切片充分舒展后晾干，烤片，隨后依次通過二甲苯及各濃度酒精中，接著放入蘇木素中染色后用自來水充分沖洗，酸化，然后用伊紅染色，最后進行透明及封片。

1.6.6 大鼠血清中白介素-6（Interleukin-6,IL-6）、腫瘤壞死因子（Tumor necrosis factor-,TNF-）含量的測定腹主動脈采血后靜置2 h，將血液在12 000 r/min（4℃）離心15 min，使用移液槍小心吸取上層血清，采用酶聯免疫分析法進行測定，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.7 統(tǒng)計學方法

計量資料均以平均數±標準差（x±s）進行統(tǒng)計，采用單因素方差分析的統(tǒng)計學方法來比較多組間均數，針對組間兩兩比較方差齊者的數據進行LSD檢驗（方差不齊者先將數據轉換后使之方差齊），P＜0.05說明差異有統(tǒng)計學意義。運用Graphpad Prism 8作圖軟件分析并處理。

2 結果

2.1 安化黑茶活性成分篩選與作用靶標預測

通過檢索中國知網及PubMed數據庫，共計獲得30個活性成分，詳見表1。其后通過TCMSP數據庫與STITCH數據庫，獲得預測作用靶點296個。

表1 安化黑茶中活性成分表Table 1 List of active ingredients in Anhua dark tea

2.2 安化黑茶防治動脈粥樣硬化靶點的獲取

分別篩選Genecards數據庫和CTD數據庫與疾病相關的靶點，其中Genecards數據庫獲取靶點2 371個，CTD數據庫獲取靶點14 899個。運用jvenn在線工具將兩數據庫疾病靶點與黑茶靶點進行交集，并通過Venn圖可視化，發(fā)現三者共有靶點有175個，涉及29個活性成分，詳見圖1。

圖1 安化黑茶與疾病的韋恩圖Fig.1 Venn diagram of Anhua dark tea and diseases

2.3 活性成分 靶點網絡及PPI網絡分析

將安化黑茶延緩動脈粥樣硬化的29個活性成分和175個關鍵作用基因導入Cytoscape軟件，構建活性成分 靶點網絡圖，其中活性成分依據節(jié)點度排名依次為槲皮素、(-)-表兒茶素-3-O-沒食子酸酯、山柰酚、楊梅素、大黃素及(-)-表兒茶素，詳見表2及圖2。借助String數據庫，輸入上述已獲得的關鍵作用基因，獲得了一個包含175個節(jié)點，3 824條邊的蛋白互作網絡圖，見圖3 A，另外排名前10的核心作用基因依次為INS、AKT1、ALB、IL6、MAPK3、VEGFA、EGF、CASP3、EGFR及JUN，詳見圖3 B。

圖3 PPI網絡及核心基因節(jié)點度排名Fig.3 Protein-protein interactions network and core gene ranking

表2 主要活性成分的節(jié)點度排名Table 2 Node ranking of major active ingredients

圖2 活性成分 靶點網絡圖Fig.2 The diagram of active ingredient-target network

2.4 核心作用基因的富集分析

將安化黑茶作用靶點進行GO功能與KEGG通路富集分析。其中共獲得GO功能富集分析2 572個，包括生物過程2 328個，細胞組成69個，分子功能175個。主要的生物過程為對營養(yǎng)水平、氧化應激和脂多糖的反應；主要的細胞組成為膜筏、膜微區(qū)及囊泡腔等，主要的分子功能為DNA結合轉錄激活因子活性、DNA結合轉錄因子結合及信號受體激活劑活性等，詳見圖4 A、4 B和4 C。共獲得622個KEGG通路富集結果，結果表明流體剪切應力和動脈粥樣硬化、晚期糖基化終末產物 糖基化終末產物受體（advanced glycosylation end products-receptor of AGEs,AGEs-RAGE）信號通路、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor,TNF）信號通路、白介素-17（IL-17）信號通路及缺氧誘導因子-1（hypoxia-inducible factor 1,HIF-1）信號通路可能在疾病的過程中發(fā)揮重要作用，詳見圖4 D。

圖4 GO功能和KEGG通路富集分析Fig.4 GO function analysis and KEGG enrichment analysis

2.5 活性成分 靶點 通路網絡圖的構建

將KEGG富集分析排名前10的主要結果與2.3得出的活性成分-靶點網絡進行匯總，得到成分 靶點通路網絡圖，其中節(jié)點度值靠前的活性成分依次為槲皮素、(-)-表兒茶素-3-O-沒食子酸酯、山柰酚及楊梅素，節(jié)點度值靠前的基因依次為PTGS2、RELA、CASP3、HSP90AA1、AKT1及IL6，提示安化黑茶能夠通過多種活性成分、多個靶點及多條通路協(xié)同延緩動脈粥樣硬化。

圖5 活性成分 靶點 通路網絡圖Fig.5 The network of active components-targets-pathways

2.6 動物實驗驗證

2.6.1 HE染色 如圖6所示，正常組可見動脈管壁光滑，內皮細胞排列連續(xù)、規(guī)則；模型組可見動脈管壁內膜明顯增厚，內皮細胞缺失，排列不整齊，夾雜泡沫細胞；阿托伐他汀組及安化黑茶各劑量組相對正常組而言，內皮細胞排列不齊，動脈管壁內膜稍增厚，但相對模型組而言，內皮細胞排列較整齊，泡沫細胞相對減少，動脈管壁內膜厚度降低，提示安化黑茶能夠延緩動脈粥樣硬化的形成。

圖6 主動脈組織病理學檢查（HE100）Fig.6 Histopathological examination of aorta(HE100 )

2.6.2 安化黑茶對動脈粥樣硬化大鼠血清IL-6和TNF-含量的影響 上述網絡藥理學結果表明抑制炎癥反應可能是安化黑茶的作用機制，本研究進一步驗證了安化黑茶對動脈粥樣硬化大鼠血清相關炎癥因子的影響。如圖7所示，模型組大鼠血清中的IL-6和TNF-含量較正常組模型升高（P＜0.01），另外阿托伐他汀組及安化黑茶各劑量組大鼠血清中的IL-6和TNF-含量較模型組降低（P＜0.01或0.05），提示安化黑茶能降低動脈粥樣硬化大鼠血清中炎癥因子IL-6和TNF-的表達水平。

圖7 安化黑茶對動脈粥樣硬化大鼠血清IL-6和TNF-a水平的影響Fig.7 Effects of Anhua dark tea on serum IL-6 and TNF-a levels in atherosclerotic rats

3 討論

動脈粥樣硬化的發(fā)病機制尚不明確，主要考慮與脂質代謝異常、慢性炎癥反應、血管內皮細胞損傷及氧化應激等有關[1]。目前，防治動脈粥樣硬化的方案常以口服他汀類藥物為主，但是隨著治療時間的延長，長期服用此類藥物會出現肝腎臟損傷等不同程度的副作用，嚴重降低患者在治療過程中的依從性。既往研究表明，飲用安化黑茶具有消食去肥膩、抗氧化及改善腸道菌群等功效[12]，然而安化黑茶作為一種水煎劑，藥效物質基礎復雜，僅靠以往的研究方法很難系統(tǒng)、全面地闡明其作用機制。

本研究發(fā)現安化黑茶中槲皮素、(-)-表兒茶素-3-O-沒食子酸酯、山柰酚、楊梅素及大黃素可能是延緩動脈粥樣硬化的主要活性成分。相關文獻亦證實了上述活性成分的作用：如槲皮素既能通過調控蛋白激酶B（Protein Kinase B,AKT1）和半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase 3,CASP3）的表達，抑制動脈粥樣硬化[13]，亦能通過抑制IL-6和單核細胞趨化蛋白1（monocyte chemotactic protein 1,MCP-1）的水平，發(fā)揮消退動脈粥樣斑塊的作用[14]；表兒茶素能夠通過降低C-反應蛋白（C-reactive protein,CRP）及核因子B（nuclear factor kappa-B,NF-B）的表達，改善血管內皮功能，減輕動脈粥樣硬化[15]；山柰酚能夠降低TNF-、IL-1及血管細胞黏附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1）的表達，延緩動脈粥樣硬化的形成[16]；楊梅素能通過抑制膽固醇蓄積，降低動脈粥樣硬化小鼠的體重及血脂水平[17]。此外亦有研究報導大黃素能夠抑制氧化應激，阻斷單核細胞遷移[18]，發(fā)揮抗動脈粥樣硬化的作用。

通過String數據庫構建的PPI網絡及活性成分靶點 通路網絡，本研究發(fā)現INS、AKT1、ALB、IL6、MAPK3、VEGFA、EGF、CASP3、EGFR、JUN、PTGS2及RELA可能是靶點蛋白相互作用的核心集群。查閱文獻后發(fā)現這些核心靶點主要與炎癥反應、細胞增殖及凋亡密切相關。如AKT1可通過參與多個與炎癥反應、細胞周期等相關的通路如AGE-RAGE信號通路、PI3K/Akt信號通路和MAPK信號通路，對相關生物學過程進行調節(jié)。MAPK3和JUN屬于MAPK家族，可通過三級激酶模式共同調節(jié)炎癥反應細胞的生長、分化及應激適應等多種生理病理過程[19]。血管內皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A,VEGFA）可在細胞膜上與其受體VEGFR結合，通過促進血管內皮細胞增殖、遷移和抑制凋亡起到促進血管生成的作用[20]。表皮細胞生長因子（epidermal growth factor,EGF）及其受體具有阻斷CD4細胞的增殖，減少動脈粥樣硬化發(fā)生的作用[21]。CASP3是細胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶，廣泛參與了心腦血管疾病的發(fā)展過程。PTGS2（COX-2）是一種重要的炎癥遞質，可誘導巨噬細胞產生IL-6等各類炎癥因子[22]。RELA又名NFKB1，NF-B是調節(jié)炎癥和各種自身免疫性疾病的關鍵轉錄因子，眾多促炎細胞因子包括TNF-、IL-1、iNOS及COX-2均可通過NF-B的激活而釋放[23]。

通過對靶點進行GO功能和KEGG通路富集分析，本研究發(fā)現流體剪切應力和動脈粥樣硬化、AGERAGE信號通路、TNF信號通路和IL-17信號通路可能在延緩疾病的過程中發(fā)揮重要作用。剪切應力是指血液流動時與血管壁面摩擦產生的切向應力，研究表明較低的切應力區(qū)域有產生動脈粥樣硬化的可能[24]，并且會誘導內皮細胞轉分化為間充質細胞，參與動脈粥樣硬化的形成過程，加大心腦血管疾病的發(fā)生風險。AGE-RAGE信號通路不僅能引起糖脂代謝紊亂、增強氧化應激，還能激活PI3K-Akt信號通路及MAPK信號通路促進炎癥反應，加重動脈粥樣硬化[25]。TNF信號通路是介導各種炎癥反應的關鍵通路,研究表明TNF-會導致血管內皮細胞大片脫落和形態(tài)改變，表明TNF-對血管內皮細胞具有直接的細胞毒作用，而抑制TNF-的表達能夠減輕細胞炎癥，延緩動脈粥樣硬化[26]。其他研究亦表明動脈粥樣硬化還與其他KEGG富集結果如IL-17信號通路和HIF-1信號通路密切相關。HIF-1是各種低氧誘導基因調控的關鍵轉錄因子，當組織缺血缺氧以及在多種炎癥因子的誘發(fā)下，HIF-1會被誘導激活，刺激血管新生，促進斑塊的發(fā)展和重塑[27]。由此可見，安化黑茶延緩動脈粥樣硬化的機制可能與調控炎癥反應、氧化應激及血管生成等病理生理反應密切相關。

上述網絡藥理學結果表明抑制炎癥反應可能是安化黑茶延緩動脈粥樣硬化的重要機制，因此本研究進一步通過動物實驗驗證安化黑茶對動脈粥樣硬化大鼠主動脈及血清中炎癥因子IL-6和TNF-含量水平的影響。IL-6是一種上游炎性細胞因子，在引發(fā)AS的炎癥反應中起核心作用。最近的臨床觀察發(fā)現，血清中IL-6的含量水平與動脈粥樣硬化的發(fā)病率呈正相關[28]，抑制IL-6的表達后能夠顯著延緩大鼠動脈粥樣硬化的形成[29]，提示其可能是防治動脈粥樣硬化的潛在靶點。TNF-同樣作為前炎癥因子，亦為公認的促動脈粥樣硬化因素[30]，且TNF-可在血管內皮沉積，損傷血管內皮。動物實驗結果證實安化黑茶能夠延緩動脈粥樣硬化的形成，并降低動脈粥樣硬化大鼠血清中的炎癥因子IL-6和TNF-含量水平，與網絡藥理學預測結果一致，增強了本研究的可靠性。

綜上所述，本研究初步探討了安化黑茶延緩動脈粥樣硬化的潛在活性成分和分子機制，發(fā)現安化黑茶中29個活性成分及175個預測靶點與動脈粥樣硬化相關，這些靶點主要與炎癥反應、氧化應激及血管生成等病理生理反應關系密切，并進行了初步實驗驗證，可為今后的藥物開發(fā)和基礎實驗提供依據。