越冬期長白山中華蜜蜂與意大利蜜蜂保護酶系活性及耐寒生理指標的測定

劉楠楠，李杰鑾，常志光

（吉林省養蜂科學研究所，吉林 吉林 132108）

長白山脈是歐亞大陸東緣的最高山系，擁有東北亞溫帶地區譜系最多的山地垂直帶系統，是我國東北地區最重要的生態屏障[1]，動植物資源獨特而豐富。長白山中華蜜蜂（Apis cerana cerana，以下簡稱長白山中蜂）是其分布區內的自然蜂種，它是在長白山生態條件下，經過長期自然選擇而形成的中華蜜蜂的一個類型[2]，廣義的長白山中蜂尚包括分布于朝鮮半島乃至俄羅斯遠東海冰邊疆地區的東方蜜蜂生態型[3]。種群在長白山脈長期棲息，形成了明顯的長白山區適應特征，特別是耐寒性較強，在﹣40℃的酷寒條件下，依然能夠自然越冬。在棲息地的喪失和碎片化以及西方蜜蜂長期干擾東方蜜蜂生殖行為等威脅因素的持續作用下，長白山中蜂數量明顯減少[4-6]，目前的種群數量已不足1萬群，處于瀕危-維持狀態[2]，遺傳資源的保護、評價和利用工作迫在眉睫。

昆蟲的抗寒生理機制極為復雜，是昆蟲長期進化過程中形成的一系列的低溫適應對策。超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）和過氧化物酶（POD）合稱昆蟲的保護酶系統[7]，能相互協作調控清除機體內活性氧，使自由基濃度維持在正常水平，構成有機體相互保護的防御系統，可作為昆蟲生理狀態改變的度量指標[8,9]。有研究表明抗氧化能力降低是蜜蜂壽命縮短和行為衰老的主要原因[10]，當蜜蜂個體處于低溫逆境條件時，昆蟲保護酶系統會對機體的氧化應激做出一系列的防御反應，誘發機體的生理代謝活動發生改變[11]；另一方面，根據越冬昆蟲體內是否存在冰晶，其越冬對策可分為避凍和耐凍兩種策略[12]，它們共同的越冬機制是小分子量糖醇物質的積累，目前已知的抗寒性物質有甘油、山梨醇、甘露醇、五碳多元醇、海藻糖、葡萄糖、果糖以及氨基酸和脂肪酸類等[13]，某些昆蟲還可以同時運用兩種策略，必要時在這兩種策略間進行轉換[14]。大多數越冬昆蟲中會由幾種抗寒物質共同構成一個抗凍保護物質系統[15,16]，蜜蜂的越冬能力很大程度上取決于其抗寒性[17]，通過減少體內自由水含量、積累抗寒物質等生理狀態的改變來增強其耐寒能力[18]，有研究認為其體內可能存在“葡萄糖 甘油 氨基酸”的抗寒物質系統[19]。

本試驗選取越冬時期最冷時段（當年12月至翌年2月）長白山中蜂和意大利蜜蜂種群的SOD、CAT和POD活性及總氨基酸（T-AA）、糖原（Glycogen）、葡萄糖（Glucose）和甘油（Glycerol）的含量進行測定，以非耐寒蜂種的意大利蜜蜂為對照，從保護酶系活性以及耐寒生理指標兩個方面明確長白山中蜂越冬耐寒的生理機制，以期為后續抗寒新品系的選育、蜂群安全越冬策略以及抗寒性狀的評價提供基礎數據。

1 材料

1.1 試驗蜂群

試驗于2019年12月至2020年2月，在吉林省養蜂科學研究所試驗蜂場進行（吉林省吉林市）。所用中華蜜蜂蜂群為純種長白山中蜂，由吉林省養蜂科學研究所國家級中蜂（長白山中蜂）保護區提供；所用意大利蜜蜂蜂群為松丹2號，由吉林省養蜂科學研究所蜜蜂遺傳資源基因保護中心提供。選取活框飼養的健康無病、無自然分蜂的長白山中蜂和意大利蜜蜂各3群作為試驗蜂群，在越冬前補喂越冬飼料，各蜂種保持群勢相當，于自然條件下室外越冬。

1.2 樣品采集

在蜂群越冬前標記兩個蜂種新出房的工蜂，選取蜜蜂越冬期的最冷時段，即當年的12月至翌年的2月，吉林地區戶外的最高和最低溫度均為零攝氏度以下。每間隔15 d（當月的10日和25日）進行一次樣品采集，置于﹣80℃超低溫冰箱內保存，備用。

1.3 主要試劑和儀器

超氧化物歧化酶試劑盒、過氧化氫酶試劑盒、過氧化物酶試劑盒，以及總氨基酸、糖原（Glycogen）、葡萄糖和甘油含量試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

Ultrospec 7000紫外可見分光光度計（英國柏楉有限公司）；Thermo Scientific Sorvall Stratos低溫高速離心機。

2 方法

2.1 保護酶系的酶活性測定

嚴格按照試劑盒說明書操作，根據公式計算得出越冬時期每個時段樣品體內的超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和過氧化物酶的活力值。測定時每組樣品做3個平行處理，所有待測樣本為同一批次。

2.2 耐寒生理指標的測定

嚴格按照總氨基酸、糖原、葡萄糖和甘油含量的試劑盒說明書操作，根據公式計算得出越冬時期每個時段樣品體內的總氨基酸、糖原、葡萄糖和甘油的含量值。測定時每組樣品做3個平行處理，所有待測樣本為同一批次。

2.3 數據處理與分析

將獲得的實驗數據應用SPSS 19.0軟件統計處理，采用數據分析中的one-way ANOVA進行單因素方差分析（P＜0.05表示差異顯著），隨后采用Tukey's HSD進行多重檢驗；應用GraphPad Prism 8.0軟件進行圖表制作。

3 結果與分析

3.1 越冬期體內保護酶系活性變化分析

3.1.1 超氧化物歧化酶活性 在越冬期的每個最冷時間段，長白山中蜂的SOD活性對比意大利蜜蜂均明顯較高，且兩個蜂種的各時間點酶活力值差異顯著（P＜0.05），見圖1。

圖1 越冬期長白山中蜂和意大利蜜蜂的SOD活性變化Fig.1 The change of SOD activity ofduring the overwintering period

3.1.2 過氧化氫酶活性 在越冬期的最冷時間段，兩個蜂種的CAT活性變化趨勢基本一致，長白山中蜂在每個時段的CAT活性均明顯高于意大利蜂，且兩個蜂種的各時間點酶活力值差異顯著（P＜0.05），見圖2。

圖2 越冬期長白山中蜂和意大利蜜蜂的CAT活性變化Fig.2 The change of CAT activity ofandduring the overwintering period

3.1.3 POD活性 在越冬期的最冷時間段，除2020年1月10日和2020年2月10日的2個時間點，長白山中蜂的POD活性均高于意大利蜜蜂，且兩個蜂種的各時間點酶活力值差異顯著（P＜0.05），見圖3。

圖3 越冬期長白山中蜂和意大利蜜蜂的POD活性變化Fig.3 The change of POD activityduring the overwintering period

3.2 越冬期體內生理指標變化分析

3.2.1 總氨基酸含量 長白山中蜂和意大利蜜蜂在越冬期的各個最冷時段體內的總氨基酸含量差異顯著，且兩蜂種間存在差異（P＜0.05）。通過比較兩蜂種在同一時間點的總氨基酸含量可發現，長白山中蜂體內的總氨基酸含量在每個時間點均顯著高于意大利蜜蜂（P＜0.05），見圖4。

圖4 越冬期長白山中蜂和意大利蜜蜂的T-AA含量變化Fig.4 The change of total amino acid content of during the overwintering period

3.2.2 糖原含量 長白山中蜂和意大利蜜蜂在越冬期的各個最冷時段體內的糖原含量差異顯著，且兩蜂種間存在差異（P＜0.05）。通過比較兩蜂種在同一時間點的糖原含量可發現，長白山中蜂體內糖原的含量在每個時間點均顯著低于意大利蜜蜂（P＜0.05），見圖5。

圖5 越冬期長白山中蜂和意大利蜜蜂的糖原含量變化Fig.5 The change of the glycogen content ofduring the overwintering period

3.2.3 葡萄糖含量 長白山中蜂在越冬期的各個最冷時段體內的葡萄糖含量存在顯著的起伏變化（P＜0.05），意大利蜜蜂則總體呈下降趨勢，且不同蜂種間存在一定差異。通過比較兩蜂種在同一時間點的葡萄糖含量可發現，除12月份的兩個時間段，其他時間點的長白山中蜂體內葡萄糖含量顯著高于意大利蜜蜂（P＜0.05），見圖6。

圖6 越冬期長白山中蜂和意大利蜜蜂的葡萄糖含量變化Fig.6 The change of glucose content ofandduring the overwintering period

3.2.4 甘油含量 長白山中蜂和意大利蜜蜂在越冬期的各個最冷時段體內的甘油含量存在顯著的變化（P＜0.05），且不同蜂種間存在一定差異。通過比較兩蜂種在同一時間點的甘油含量可發現，除2020年1月10日和2020年2月25日兩個時間點，其他時段的長白山中蜂體內甘油含量顯著高于意大利蜜蜂（P＜0.05），見圖7。

圖7 越冬期長白山中蜂和意大利蜜蜂的甘油含量變化Fig.7 The change of the glycerol content ofduring the overwintering period

4 討論

長白山陸地生態系統呈多重景觀格局，季節性寒冷是長白山區重要的限制性生態因子之一。長白山中蜂是長白山生態系統中寶貴的種質遺傳資源[20]，是長期適應冬季寒冷，無霜期短等嚴酷生態環境具有強大適應性的特殊種群、了解它在越冬期的抗寒適應性生理機制對于種群的保護利用十分必要。

昆蟲耐寒性體現出對環境適應的能力，與生態環境的季節性變化、遺傳因素、營養狀況和暴露低溫的時間長短等因素相關，是種群能否成功越冬與翌年繁殖的重要前提[21]，機體內保護酶系的活性變化可作為昆蟲抗逆能力的重要指標[22]。根據吉林地區2019年12月至2020年2月冬季氣候資料（中國氣象數據網：http://data.cma.cn），最高氣溫和最低氣溫均在0℃以下，為越冬蜂群經歷的最冷氣候階段，自然條件下室外越冬種群的耐寒性試驗結果更能代表兩個蜂種真實的耐寒性水平。本研究結果表明，在越冬期最寒冷的3個月時間段內長白山中蜂體內的SOD和CAT的活性顯著高于意大利蜜蜂，總體的POD活性表現也高于意大利蜜蜂，且整體的酶活力值并無明顯下降，說明越冬期長白山中蜂的保護酶系統可能存在一定的抗氧化應激防御機制，在冬季低溫的不利環境下協同發揮增效作用，幫助蜜蜂個體在越冬期間增強耐寒性，且整體表現優于意大利蜜蜂。與夏振宇等[23]發現中國北方越冬期的中華蜜蜂體內抗氧化系統防御能力趨強，對低溫脅迫存在耐寒響應生理機制的研究結果一致。

越冬昆蟲要經歷漫長的越冬期，不僅需要消耗一定的能量物質來維持正常代謝，同時需要自身一系列生理生化反應以應對低溫不利環境，糖原和脂肪是越冬前重要的能量儲備物質[24]，在越冬階段或低溫脅迫刺激下還會在體內大量積累低分子糖、醇類物質作為抗凍保護物質以增強昆蟲耐寒性[25-27]，這些化合物具有避免昆蟲結冰、融化和提高長時間冷暴露條件下的存活率的作用，能夠客觀反映昆蟲的耐寒性生理響應機制，它們可作為越冬昆蟲的耐寒性指標[28]。本研究的結果表明，長白山中蜂在越冬期最冷時段體內的總氨基酸、糖原、葡萄糖和甘油含量有明顯的波動變化，說明面對外界低溫存在一定的生理應答機制，蜜蜂個體抵御冬季低溫不僅是單一物質積累而是多元抗凍保護物質互相協調共同作用的復雜過程，其中總氨基酸、葡萄糖和甘油的含量總體上要顯著高于意大利蜜蜂，它們可能是長白山中蜂越冬期關鍵的抗凍保護物質。Xu等[19]對20日齡的中華蜜蜂和意大利蜜蜂工蜂進行0℃、10℃和25℃持續4 h的溫度處理發現，在低溫脅迫下中華蜜蜂通過轉化氨基酸為能量來抵御寒冷，有17種氨基酸參與機體的抗寒機制，而意大利蜜蜂只有15種。糖類物質和甘油是昆蟲的主要抗寒保護劑，誘導產生的耐寒性小分子化合物，與結合水結合增加體液濃度從而降低過冷卻點，也可以與酶等物質相互作用來保護昆蟲[29]，且它們存在相互轉換的關系，二化螟越冬幼蟲體內的葡萄糖和糖原在越冬期間會向甘油進行轉化[30]。

長白山中蜂在長期適應性進化過程中通過越冬耐寒鍛煉提高了對低溫和亞低溫的耐受性，獲得了抵御冬季寒冷溫度的多種耐逆性機制，包括越冬期間抗凍保護物質在其體內的生物合成、積累、代謝以及保護酶系的防御調控，以增強種群的耐寒性。本試驗結果加強了對長白山中蜂種群耐寒性狀的綜合理解，為明確種群的抗寒能力和耐寒策略提供科學依據，其中抗氧化酶、氨基酸、葡萄糖和甘油之間在調節機體耐寒功能的分子研究需要更進一步地展開。