‘申鴻七彩雉雞’mtDNA全基因組序列測序和系統發育關系分析

陳芳，覃健峰，鄭德濱，袁紅艷，吳瓊※

（1.龍巖學院生命科學學院，福建 龍巖 364012；2.上海欣灝珍禽育種有限公司，上海 201400）

雉雞，學名環頸雉，俗稱野雞、山雞。在動物分類學屬于鳥綱（Aves）雞形目（Gallinales）雉科（Phasianidae）雉屬（Phasianus）。雉雞在我國飼養較早，3 000年前殷商甲骨文中記載有“雉”字。《本草綱目》詳細記載了雉雞各部位的藥用價值[1,2]。在野生狀態下，雉雞分為30個亞種，其中在我國境內分布有19個亞種，除西藏和海南外，全國各地均有分布。我國對雉雞大規模馴養和研究始于20世紀60年代，1981年獲得成功，自此雉雞人工養殖技術在全國范圍內進行了大規模的推廣普及。我國雉雞飼養業歷經30多年的發展，從無到有，從小到大，得到了飛速的發展[3]。

‘申鴻七彩雉雞’（Shenhong pheasant）是2011年由上海欣灝珍禽育種有限公司聯合中國農業科學院特產研究所等4家單位歷經7年聯合選育的肉蛋兼有型雉雞新品種，2019年通過國家畜禽遺傳資源委員會審定。‘申鴻七彩雉雞’18周齡上市體重公雉達1 350 g、母雉雞達1 000 g，飼養56周齡日產蛋130個。與其他雉雞品種相比，生長速度快、肉用性能好且產蛋多，中試結果體現了較強的適應性，具有先進的綜合生產性能，符合市場需求，具有廣闊的推廣前景。

線粒體基因組結構簡單，編碼基因內不含內含子，能夠獨立地進行復制和轉錄，世代間無基因重組。線粒體嚴格遵循母系單性遺傳的特性，單一的一個樣本就能夠攜帶群體的全部基因，代表一個母系群體特征，通過少量的樣本就能夠對群體的遺傳結構進行全面分析，而且結果可靠，有利于群體遺傳研究[4,5]。‘申鴻七彩雉雞’的線粒體全基因組序列目前還未見報道，本研究利用PCR測序方法，獲得‘申鴻七彩雉雞’線粒體全基因組全長序列，并與其他雉雞序列構建系統進化樹，為‘申鴻七彩雉雞’種質資源的保護和利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

樣本來自上海欣灝珍禽育種有限公司3層籠養的‘申鴻七彩雉雞’3個個體。翅靜脈采血，EDTA抗凝，充分混勻保存于﹣20℃冰箱備用。

1.2 血液DNA提取和鑒定

參照南京諾維贊生物科技股份有限公司的全血基因組DNA快速提取試劑盒（柱式），具體步驟見說明書。利用瓊脂糖凝膠電泳檢測，在凝膠成像系統中觀察電泳結果，DNA條帶為單一致密的樣品可作為后續試驗材料，說明DNA質量較好且無降解。利用分光光度法檢測DNA濃度，樣品的OD260nm/OD280nm比值在1.6～1.8之間，則表明DNA純度較高。檢測合格后放置﹣20℃冰箱備用。

1.3 引物設計

根據線粒體DNA環狀雙鏈閉合的結構特點，參照NCBI中已公布的雉雞線粒體基因組全序列（登錄號：FJ752430），Primer Premier 5.0和Oligo 6.0設計覆蓋雉雞線粒體全序列的引物，見表1，由上海生物工程有限公司合成。新合成引物需低速離心后，按照引物合成單上的說明，用滅菌雙蒸水稀釋到20 m，室溫溶解3 h以上，然后﹣20℃保存。

表1 擴增片段的PCR引物Table1 Primers for PCR

1.4 PCR擴增及測序

根據提取的DNA模板長度進行PCR，對反應體系進行優化配置，并通過梯度PCR摸索合適的退火溫度及反應條件。PCR反應體系為25L：2 Es Taq MasterMix 15L、上下游引物各0.5L，DNA模板1.0L，dd H2O 11.5L。PCR反應條件為：預變性94℃，5 min，變性94℃，30s，退火以實際摸索的溫度，30s，延伸72℃，60 s，再延伸72℃，5 min，循環數為35次。PCR產物在1%瓊脂糖凝膠（含核酸染料）上進行電泳，在凝膠成像系統中觀察并拍照保存。選取符合條件的PCR產物送往上海生物工程股份有限公司測序。

1.5 數據分析

1.5.1 使用Geneious軟件進行雉雞線粒體全基因組序列注釋分析。

1.5.2 構建進化樹，建進化樹之前，使用Dambe 5進行堿基替換飽和性分析，在核苷酸序列顯示未飽和的前提下，方可建樹[6]。使用jModelTest 2.1.7[7]計算似然值，基于BIC標準對數據進行模型選擇[8]，線粒體13個蛋白質編碼基因的最優模型為HKY+I+G。使用Mega 7.0軟件采用最大似然法（Maximum Likelihood method,ML）構建系統進化樹，自舉檢驗參數設置為1 000次。

2 結果與分析

2.1 基因組DNA提取、PCR擴增及測序結果

圖1 基因組DNA電泳圖Fig.1 Electrophoretic analysis of genomic DNA

2.2‘申鴻七彩雉雞’線粒體基因組的序列分析

組裝注釋得到‘申鴻七彩雉雞’3個樣品的全線粒體基因組，3個樣品的線粒體基因組完全相同，全長為16 685 bp。結構均為典型的環狀雙鏈，包括13個蛋白質編碼基因（ND1、ND2、COX1、COX2、ATP8、ATP6、COX3、ND3、ND4L、ND4、ND5、CYTB和ND6）、2個rRNA（12S rRNA和16S rRNA）、22個tRNA和一個非編碼的控制區（D-Loop）。

‘申鴻七彩雉雞’13個蛋白編碼基因總長度平均為11 369 bp，占整個基因組的68.13%，其中ND6由L鏈編碼，其余均由H鏈編碼。‘申鴻七彩雉雞’最長的蛋白質編碼基因是ND5，為1 818 bp，最短的是ATP8基因，為165 bp。13個蛋白質編碼基因中，密碼子規律同中國環頸雉。基因重疊有7處，總長度為30 bp；基因間隔為20處，總長度為52 bp；基因間無間隔和重疊有11處。

表2 ‘申鴻七彩雉雞’線粒體基因組基因定位和特征表Table 2 Gene locations of mitochondrial genome of'Shenhong pheasant'

續表2

2.3 rRNA和D-loop序列控制區

‘申鴻七彩雉雞’12S rRNA和16S rRNA長度分別為966 bp和1 619 bp，占整個基因組的5.79%和9.70%。兩個rRNA位于tRNA-Phe和tRNA-Leu（UUR）之間，被tRNA-Val基因分隔開。D-loop序列控制區位于tRNA-Phe和tRNA-Glu之間，序列長為1 148 bp，占整個基因組的6.88%。

2.4 tRNA

tRNA基因共有22個，長度為65～78 nt，tRNA全長為1 541 bp，占整個基因組的9.24%。tRNA基因中最長為tRNA-Trp，最短為tRNA-Ser（AGY）。tRNA均可以折疊形成三葉草結構。

2.5‘申鴻七彩雉雞’線粒體基因組堿基組成特征

‘申鴻七彩雉雞’線粒體全基因組、蛋白質編碼基因、tRNA、rRNA和D-Loop區堿基組成見表3。所有基因AT含量均大于CG含量，D-Loop區的AT含量最高，為60.02%，其次是含量為58.73%的tRNA，最低為PCG，含量55.33%。

表3 ‘申鴻七彩雉雞’線粒體基因組堿基組成Table 3 Base composition of mitochondrial genome of'Shenhong pheasant'

2.6‘申鴻七彩雉雞’與其他雉雞進化關系

選擇NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）發布的7條雉雞線粒體全基因組序列，包括日本綠雉2條、環頸雉4條和甘肅亞種雉雞1條，與本研究的‘申鴻七彩雉雞’均提取13個蛋白質編碼基因序列。構建的系統發育樹顯示，10個雉雞種群分為兩支，‘申鴻七彩雉雞’和‘甘肅亞種雉雞’聚在一起。日本綠雉和環頸雉聚在一起（圖2和圖3）。

圖2 基于蛋白質編碼基因的‘申鴻七彩雉雞’與雉雞進化樹（ML）Fig.2 Electrophoretic analysis of genomic DNA

圖3 基于蛋白質編碼基因的‘申鴻七彩雉雞’與雉雞進化樹（NJ）Fig.3 Electrophoretic analysis of genomic DNA

3 討論

3.1 ‘申鴻七彩雉雞’線粒體基因組的大小和密碼子使用

‘申鴻七彩雉雞’的線粒體基因組與其他鳥類動物相似，為環狀雙鏈DNA分子。線粒體蛋白質編碼基因的密碼子使用，作為起始密碼子，線粒體13個蛋白質編碼基因中9個基因使用ATG，ATG是動物最常用的起始密碼子，2個基因使用ATA，NAD5基因使用ATA。在鳥類動物中，NAD4L基因都使用GTG作為起始密碼子，GTG是真核生物線粒體基因組中特有的起始密碼子。作為終止密碼子，大多基因使用完整終止密碼子TAA、TAG和AGA，少數使用不完整終止密碼子T。李喜鳳[9]分析了環頸雉線粒體基因組全序列，全長為16 692 bp，包括13個蛋白質編碼基因、22個tRNA基因、2個rRNA基因和一個非編碼控制區；環頸雉的控制區長度為1 147 bp，可分為3個區：domain I～III；本研究中‘申鴻七彩雉雞’的線粒體基因組結構、堿基組成和基因排列順序均與雞形目其他物種相似。

3.2 基于線粒體編碼蛋白基因‘申鴻七彩雉雞’分子系統進化關系

吳瓊等[10]關于線粒體細胞色素b基因序列的研究顯示，日本綠雉單成一個系，‘中國環頸雉’‘蒙古雉雞’‘黑化雉雞’‘申鴻七彩雉雞’混在一支。‘申鴻七彩雉雞’是我國野生雉雞馴化后的中國山雞與上海本地飼養的山雞雜交形成的品種，上海本地山雞為90年代初我國從美國引進的中國環頸雉，長期飼養適應本地條件而形成的雉雞種群。劉影[11]關于線粒體基因組全序列的研究顯示，‘美國七彩山雞’（中國環頸雉）來源于野生雉雞亞種，這與本研究中‘申鴻七彩雉雞’與‘甘肅亞種雉雞’互為姐妹群相一致。

4 結論

‘申鴻七彩雉雞’的線粒體DNA基因組全長為16 685 bp，為典型的環狀雙鏈DNA分子，其線粒體基因組結構、堿基組成和基因排列順序均與雞形目其他物種相似。‘申鴻七彩雉雞’與‘甘肅亞種雉雞’互為姐妹群。