19種加工辣椒辣椒素提取、純化及其含量測定

霍瑞春，王國澤，姚慧靜，袁鶴，周剛，程立坤*

(1.內(nèi)蒙古科技大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014010；2.包頭市農(nóng)牧業(yè)科學(xué)研究院，內(nèi)蒙古 包頭 014010)

辣椒(CapsicumannuumL.)，茄科一年生草本植物，是一種藥食同源蔬菜。辣椒原產(chǎn)于美洲，明朝末年傳入我國后[1]，因其獨特的口感深受人們的喜愛。辣椒中與辣味相關(guān)的物質(zhì)統(tǒng)稱為辣椒素(capsaicins)，最早由Thresh[2]從辣椒果實中分離出來。隨后Bennet D J等[3]分析了辣椒素的化學(xué)組分，發(fā)現(xiàn)辣椒中的辛辣成分是由一系列同系物或相似物組成，它們被統(tǒng)稱為辣椒素類物質(zhì)。

辣椒素(反式-8-甲基-N-香草基-6-壬烯酰胺)又名辣素、辣椒堿，其分子結(jié)構(gòu)式見圖1，是一種無色片狀結(jié)晶化合物。目前，人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)20余種辣椒素類物質(zhì)，其中辣椒素(69%)和二氫辣椒素(22%)含量最高，約占總含量的90%以上[4-6]。辣椒素通常由辣椒胎座合成，是一種常見的天然食品添加劑、辣味調(diào)味品。因其辛辣的風(fēng)味，所以具有增加食欲、開胃消食等作用[7-8]。此外，辣椒素還具有抗癌[9-10]、抗疲勞[11]、長效鎮(zhèn)痛[12]、抗病蟲害[13]等作用。

圖1 辣椒素分子結(jié)構(gòu)式Fig.1 The molecular structure formula of capsaicins

辣椒素的含量及辣度(Scoville Heat Unit，SHU)的高低是評價辣椒品質(zhì)及其制品質(zhì)量的重要依據(jù)。目前市場上的辣椒沒有鮮明的辣椒素及辣度分級標(biāo)識，這會混淆辣椒的加工方式、方法，從而影響辣椒加工產(chǎn)品的風(fēng)味。本文測定了包頭本地自選育的19種加工辣椒的辣椒素含量并對其進行了辣度分析，從而得出不同辣度辣椒適合的加工方法，希望為辣椒、辣椒制品及辣椒的良種選育和原料加工提供重要的參考依據(jù)[14]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

本實驗的辣椒材料均采自包頭市農(nóng)牧業(yè)科學(xué)研究院，辣椒品種栽培管理方法條件一致。實驗樣品一致性較好，表面無創(chuàng)傷，無明顯病蟲危害。樣品采摘后立即儲存于-18 ℃冷凍室內(nèi)。

辣椒素標(biāo)準(zhǔn)品(≥99%)、二氫辣椒素標(biāo)準(zhǔn)品(≥99%)：均采購于上海源葉生物科技有限公司；乙腈(色譜純)、甲醇(色譜純)：采購于上海麥克林生化科技有限公司。

DHG-9023A電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；MC8S-1A微波萃取儀 南京匯研微波系統(tǒng)工程有限公司；UV-7504紫外分光光度計 上海欣茂儀器有限公司；Thermo U3000超高效液相色譜儀 賽默飛世爾科技(中國)有限公司；JA5003電子天平 上海佑科儀器儀表有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 辣椒素的提取

辣椒素的提取參考孫勝枚[15]的方法略加改良。辣椒去籽、去梗，于60 ℃恒溫干燥箱中烘干，粉碎過40目篩，備用。稱取上述辣椒粉末5 g于250 mL 錐形瓶中，加入60 mL 80%的乙醇溶液微波300 W提取20 min，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得辣椒素粗制品[16]。

1.2.2 辣椒素的純化

稱取100 g D101大孔樹脂，用95%乙醇浸泡24 h后，采用濕法裝柱。用乙醇沖洗樹脂，直到流出液加水變澄清，再用蒸餾水沖洗乙醇，直到無乙醇味[17]。用2～4 BV 10%鹽酸沖洗，浸泡3 h，用蒸餾水沖洗，直到流出液pH變?yōu)?～7。用2～4 BV 7%氫氧化鈉沖洗，浸泡3 h，用蒸餾水沖洗，直到流出液pH變?yōu)?～7。辣椒素粗提液過濾后，沿壁緩慢倒入樹脂，待吸附平衡后用7.5 BV 80%乙醇以1 mL/min的速度洗脫[18]。

1.2.3 辣椒素的測定

1.2.3.1 辣椒素標(biāo)曲的測定[19]

稱取1 mg辣椒素標(biāo)準(zhǔn)品和二氫辣椒素標(biāo)準(zhǔn)品，經(jīng)乙醇溶解后定容至10 mL作為儲備液(濃度1 mg/mL)。吸取儲備液0.01，0.02，0.04，0.06，0.08，0.1，0.12 mL于10 mL容量瓶中，用乙醇定容，配制成質(zhì)量濃度為10，20，40，60，80，100，120 μg/mL的辣椒素和二氫辣椒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，待HPLC進樣檢測分析。

1.2.3.2 色譜條件

AcclaimTMC18色譜柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm)，柱溫：30 ℃，流動相：水-乙腈(30∶70，V/V)，流速：1.0 mL/min，檢測波長：280 nm，進樣量：10 μL，運行時間：40 min[20]。

1.2.4 辣椒辣度SHU的計算方式

辣椒辣度SHU的計算方法按下式進行計算：

SHU=(X1+X2)×(16.1×103)+(X1+X2)/90%×10%×(9.3×103)。

式中：X1為辣椒素含量，mg/g；X2為二氫辣椒素含量，mg/g；90%為辣椒素與二氫辣椒素折算為辣椒素類物質(zhì)總量的系數(shù)。

SHU與辣度級別換算見表1。

表1 SHU與辣度級別換算Table 1 The conversion between SHU and spiciness level

2 結(jié)果與分析

2.1 辣椒素檢測波長的確定

在200～340 nm波長范圍內(nèi)掃描辣椒素標(biāo)準(zhǔn)品(二氫辣椒素標(biāo)準(zhǔn)品)溶液，得到的紫外可見光譜掃描結(jié)果見圖2。

由圖2可知，辣椒素和二氫辣椒素的最大紫外吸收波長在230 nm和280 nm處?？紤]到實驗所使用的流動相為乙腈和水，乙腈的紫外截止波長在210 nm左右，在230 nm處檢測雜質(zhì)峰多，因此選擇280 nm作為紫外檢測器的檢測波長。

圖2 辣椒素(二氫辣椒素)標(biāo)準(zhǔn)品紫外可見光譜掃描圖Fig.2 The ultraviolet visible spectra scanning diagram of capsaicins (dihydrocapsaicins) standard samples

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

由圖3可知，二氫辣椒素標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為Y=0.0037X+2.2399，相關(guān)系數(shù)為0.9961，辣椒素標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為Y=0.0047X+2.2174，相關(guān)系數(shù)為0.9925，表明辣椒素和二氫辣椒素在10～120 μg/mL范圍之間與吸光度有良好的線性關(guān)系，該方法可作為辣椒素和二氫辣椒素含量的分析方法。

2.3 辣椒素萃取條件的確定

微波萃取實驗條件的優(yōu)化主要包括溶劑、萃取功率、萃取時間、萃取溫度和料液比的選擇。由于辣椒素是熱不穩(wěn)定的香草基肽胺類化合物，在較高溫度下容易揮發(fā)而損失，因此，萃取功率過高、萃取時間過長或者萃取壓力過大都可能導(dǎo)致萃取產(chǎn)率降低。

2.3.1 萃取溶劑的選擇

為了高效快速地提取辣椒素，選取提取溶劑是至關(guān)重要的一步。根據(jù)辣椒素的物理性質(zhì)，本實驗選取甲醇、無水乙醇和丙酮3種溶劑進行了比較[21]，結(jié)果見圖4。

圖4 不同溶劑對提取效果的影響Fig.4 Effect of different solvents on the extraction effect

由圖4可知，無水乙醇對辣椒素的提取率最高，丙酮次之，甲醇最小，且無水乙醇與丙酮和甲醇之間均存在顯著性差異，故選擇無水乙醇作為辣椒素及二氫辣椒素的提取溶劑。

2.3.2 乙醇濃度的選擇

乙醇濃度不同，其對辣椒組織的滲透效果也會不同，因而對辣椒素的提取效果也會有所差異。由圖5可知，70%的乙醇提取效果最佳，乙醇濃度較低，辣椒素不能充分溶出；乙醇濃度較高，辣椒素得率較低，故選擇70%的乙醇作為提取溶劑。

圖5 乙醇濃度對提取效果的影響Fig.5 Effect of ethanol concentration on the extraction effect

2.3.3 微波功率的選擇

初步選擇萃取時間為10 min、萃取溫度為30 ℃、料液比為1∶5，以70%的乙醇作為提取溶劑，考察了微波功率對辣椒素萃取的影響，結(jié)果見圖6。

圖6 微波功率對提取效果的影響Fig.6 Effect of microwave power on the extraction effect

由圖6可知，當(dāng)微波功率達到200 W時，辣椒素和二氫辣椒素的提取含量都達到最大。因此，本實驗選擇微波萃取功率為200 W。

2.3.4 微波提取時間的選擇

控制萃取時間的目的是為了控制加熱程度，使萃取在最佳條件下進行以獲得最大產(chǎn)率。選擇萃取功率為200 W、萃取溫度為30 ℃、料液比為1∶5，以70%的乙醇作為提取溶劑，考察了萃取時間對辣椒素產(chǎn)率的影響，結(jié)果見圖7。

圖7 微波提取時間對提取效果的影響Fig.7 Effect of microwave extraction time on the extraction effect

由圖7可知，辣椒素的含量隨著萃取時間的延長而升高，當(dāng)萃取時間達到30 min時，產(chǎn)率最大。此后，隨著萃取時間的增加產(chǎn)率降低，故選擇微波萃取時間為30 min。

2.3.5 微波提取溫度的選擇

根據(jù)辣椒素的物理性質(zhì)，辣椒素會隨著溫度的升高而揮發(fā)，因此控制萃取溫度以求獲得最大產(chǎn)率。萃取條件控制在微波功率200 W、萃取時間30 min、料液比1∶5，以70%的乙醇作為提取溶劑，考察萃取溫度對辣椒素含量的影響，結(jié)果見圖8。

圖8 溫度對提取效果的影響Fig.8 Effect of temperature on the extraction effect

由圖8可知，當(dāng)溫度為30 ℃時，得率達到最大值。溫度再升高得率明顯降低。所以，本實驗選定30 ℃為提取溫度。

2.3.6 料液比的選擇

合適的料液比能提高辣椒素的得率，為了得到辣椒素的最佳得率，本實驗以70%的乙醇作為提取溶劑，在微波功率200 W、萃取時間30 min、萃取溫度30 ℃的條件下考察了不同料液比對辣椒素得率的影響，結(jié)果見圖9。

由圖9可知，料液比對得率的影響較大。當(dāng)料液比減少時得率迅速上升，但當(dāng)料液比達到1∶15時得率增加不再明顯，固液之間交換基本達到平衡。為節(jié)約溶劑且便于回收，本文選擇1∶15作為提取料液比。

圖9 料液比對提取效果的影響Fig.9 Effect of solid-liquid ratio on the extraction effect

2.4 正交實驗設(shè)計

為進一步確定提取辣椒素的最優(yōu)工藝條件，在上述實驗的基礎(chǔ)上選擇乙醇濃度、提取功率、提取時間、料液比設(shè)計正交實驗，研究其對辣椒素提取效果的綜合影響。因素水平安排結(jié)果見表2～表4。

表2 辣椒素和二氫辣椒素提取工藝L9(34)正交實驗因素水平表Table 2 The factors and levels of L9(34) orthogonal experiment for extraction process of capsaicins and dihydrocapsaicins

表3 辣椒素和二氫辣椒素提取工藝L9(34)正交實驗結(jié)果Table 3 L9(34) orthogonal experiment results for extraction process of capsaicins and dihydrocapsaicins

由正交實驗分析可知，影響辣椒素和二氫辣椒素得率的反應(yīng)條件中各因素主次順序為C>A>B>D，即微波功率>乙醇體積分?jǐn)?shù)>微波時間>料液比。C因素中k3>k1>k2，因此C因素的優(yōu)水平為C3，同理可分析A、B、D的優(yōu)水平分別為A3、B1、D1。故辣椒素提取的最優(yōu)水平組合為A3B1C3D1，即最佳工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、提取時間20 min、微波功率300 W、料液比1∶12。

表4 辣椒素和二氫辣椒素含量方差分析Table 4 Analysis of variance of content of capsaicins and dihydrocapsaicins

2.5 不同品種辣椒素及二氫辣椒素含量

2.5.1 HPLC測定標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖10可知，辣椒素標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程是Y=0.0837X+1.5245，相關(guān)系數(shù)為0.9941，表明辣椒素在10～100 μg/mL范圍之間與吸光度線性關(guān)系良好。二氫辣椒素標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程是Y=0.063X+0.0383，相關(guān)系數(shù)為0.9991，表明二氫辣椒素在2～50 μg/mL范圍之間與吸光度有良好的線性關(guān)系。

2.5.2 對照品和樣品色譜分離圖

該色譜條件下，辣椒中辣椒素和二氫辣椒素得到很好分離，保留時間一致，辣椒素的保留時間約為5.3 min，二氫辣椒素的保留時間約為6.5 min，結(jié)果見圖11。

2.5.3 HPLC檢測辣椒素類物質(zhì)含量

按照上述正交實驗得出的提取方法對19種辣椒進行辣椒素和二氫辣椒素的提取，通過HPLC進行檢測，結(jié)果見表5。

表5 辣椒素和二氫辣椒素含量Table 5 The content of capsaicins and dihydrocapsaicins mg/g

續(xù) 表

由表5可知，CF-21、HN1906-3、奧黛麗及先甜1號中并未檢測出辣椒素及二氫辣椒素，這類辣椒屬于甜椒或菜椒。剩余品種辣椒中辣椒素類物質(zhì)含量最高的是艷椒425，其含量為0.353 mg/g，辣椒素類物質(zhì)含量最低的是TL 8-1-2，其含量為0.021 mg/g。

2.6 19份辣椒辣度等級分布

由表6可知，19份辣椒材料中辣椒辣度主要集中在1～5級，其中1級辣椒的出現(xiàn)頻次最高，占比31.57%；其次是3級辣椒的出現(xiàn)頻率，占比26.31%，這類辣椒辣味比較醇厚，適用于火鍋及串串香底料等；最后出現(xiàn)頻率較高的是辣度級別為4的辣椒，占比15.78%，這類辣椒辣味比較突出，比較適合加工辣椒紅油。

表6 19份辣椒辣度與辣度等級分布Table 6 The distribution of spiciness and spiciness levels of 19 kinds of peppers

3 結(jié)論

我國辣椒的種類繁多，但其辣椒素及辣度分級標(biāo)識過于籠統(tǒng)，導(dǎo)致同一產(chǎn)品的口味出現(xiàn)差異，從而約束了辣椒產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。實驗對包頭本地自選育的19種加工辣椒的辣椒素類物質(zhì)進行HPLC檢測和辣度分析，結(jié)果得出：艷椒425、沙爾沁辣椒辣椒素類物質(zhì)含量較高，分別為0.353 mg/g和0.314 mg/g，其辣度達到6級，說明艷椒425和沙爾沁辣椒能夠用作辣椒素提取候選品種之一，此外，此類較辣的品種還能夠用來制作辣味火鍋配料、泡椒、干辣椒等。實驗發(fā)現(xiàn)TL 8-1-2辣椒素類物質(zhì)含量最低，為0.021 mg/g，辣度為1級，由于此類辣椒辣味較低，通常用作鮮食蔬菜來品嘗其獨特的風(fēng)味而不用作調(diào)味料。而411-2、366-3和博辣紅星辣椒辣度為4級，這類辣椒常被用來醬制或油制。此外，未檢出辣椒素的辣椒品種，其屬于甜椒一類，這類辣椒口感微甜，通常被當(dāng)作水果鮮食。

總之，不同品種辣椒辣椒素含量和辣度也不盡相同，其用途極為廣泛，具有廣闊的發(fā)展市場。