復合棗醋酒精發酵菌種的篩選及工藝研究

王曉婧，王星星，王萌，賈艷蘭

(山西工商學院，太原 030006)

壺瓶棗是山西省太谷縣的一大特色農產品，棗肉中的類黃酮、總酚等含量十分高[1]。壺瓶棗含糖量高，每100 g果肉中含糖量約30～50 g，可以被酵母菌利用[2]，由于壺瓶棗成熟后容易落果，雨天出現大量裂棗，裂棗不利于運輸儲存，造成很多浪費而影響收入，裂棗的開發利用成為研究熱點[3-4]。山西呂梁的沙棘占地面積廣，沙棘是一種落葉灌木或小樹[5-6]，沙棘果實營養物質豐富，如氨基酸是鹿茸的5倍，多酚類化合物是人參的4倍；其中維生素含量最高，是蘋果的200多倍，被稱為“Vc之王”[7-8]。

現階段人們生活水平普遍提高，健康飲食觀念現在深入人心，針對消費者的健康需求，零蔗糖添加的果醋成為新的研究趨勢。果醋產品的開發，很大程度上提高了資源的合理利用效率，減少了因人為或自然條件引起的果蔬資源浪費，對社會經濟建設起到了極有力的推動作用。

壺瓶棗糖含量高，利于酵母菌發酵，不需要添加糖類也可以達到發酵所需的糖度，而沙棘的糖含量超低，有機酸高，難以單獨發酵，可以把沙棘加入到棗漿中調節pH，把兩者的優點集中在一起，在棗醋的口感、香味等方面改變，傳統的棗醋發酵需要先調節糖度再進行酒精發酵，本試驗在酒精發酵階段采用酵母菌和乳酸菌進行混菌發酵，并進行工藝優化。

本文以壺瓶棗、沙棘為原料進行液態發酵制備復合果醋，選擇接種酵母菌和乳酸菌進行混合菌種發酵，通過測定發酵液的酒精度和還原糖含量，篩選出酵母菌和乳酸菌的種類和接種量。以發酵液的酒精度、還原糖為評價指標，在乳酸菌接種量、發酵pH、發酵溫度的單因素試驗結果的基礎上，采用Box-Behnken進行試驗設計，用響應面分析法對棗醋酒精發酵條件進行工藝優化，確定最佳工藝條件。

1 材料和方法

1.1 材料

壺瓶棗(裂棗)；沙棘：太原市小店區美特好超市；安琪葡萄酒·果酒專用酵母RW、SY：安琪酵母股份有限公司；嗜酸乳桿菌、雙歧桿菌、嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌：西安綠藤生物科技有限公司。

1.2 試劑

鹽酸(HCl)、硫酸銅(CuSO4·5H2O)、氫氧化鈉(NaOH)、乙酸鋅[Zn(CH3COO)2·2H2O]、冰乙酸(C2H4O2)、酚酞：天津市風船化學試劑科技有限公司；亞甲藍(C16H18ClN3S·3H2O)：天津市北辰方正試劑廠；酒石酸鉀鈉(C4H4O6KNa·4H2O)：天津市凱通化學試劑有限公司；亞鐵氰化鉀[K4Fe(CN)6·3H2O]：天津市申泰化學試劑有限公司。

1.3 主要儀器與設備

BCD-521WDPW型冰箱 青島海爾集團；JA2003型電子天平 上海菁海儀器有限公司；HH-T600型電熱恒溫水浴鍋 常州市雙舜儀器設備有限公司；JP12D-800型多功能榨汁機 蘇泊爾集團有限公司；HH-S2型數顯二孔恒溫水浴鍋、TS-2102C型恒溫振蕩培養箱、TGL-16GB型高速臺式離心機 常州市金壇大地自動化儀器廠；萬用電爐、酒精計 北京科偉永興儀器有限公司；DK-8B型電熱恒溫水槽 上海精宏實驗設備有限公司；PHS-3C型實驗室pH計 上海佑科儀器儀表有限公司；WZ-108型折光儀 北京萬成北增精密儀器有限公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 復合果醋的釀造工藝流程[9-11]

壺瓶棗、沙棘→篩選→清洗→預煮→打漿→酶解(果膠酶)→壺瓶棗沙棘混合液→接種(酵母菌RW、保加利亞乳桿菌)→酒精發酵→發酵結束→接種醋酸菌→醋酸發酵→過濾→調配→殺菌→壺瓶棗沙棘復合醋。

1.4.2 操作要點

1.4.2.1 原料挑選

新鮮的壺瓶棗(半紅期至全紅期裂棗)、沙棘[12]。

1.4.2.2 破碎、榨汁

破碎、去核，將果肉放入多功能榨汁機中，按質量比加入水打漿，再將棗漿與沙棘汁按一定比例混勻，得到混合液。

1.4.2.3 酶解

將混合液升溫至55 ℃，并加入0.2%的果膠酶，恒溫酶解3.5 h，于90 ℃水浴鍋中滅酶5～10 min。

1.4.2.4 酒精發酵

以酶解完成的混合液為原料，接入適量安琪酵母、保加利亞乳桿菌置于恒溫振蕩培養箱中進行2 d的酒精發酵[13]。

1.4.2.5 醋酸發酵

加入食品質量與安全微生物實驗室二次擴培的醋酸菌進行醋酸發酵[14]。

1.4.3 酵母菌菌種及接種量的確定

以酶解后的壺瓶棗、沙棘混合液為基料，分別接種酵母RW和SY 0.2%進行發酵，發酵溫度25 ℃，發酵時間2 d，酒精發酵結束后，按照1.5.1和1.5.2的方法測定還原糖和酒精度，確定酵母菌菌種[15-17]。

在確定酵母菌的菌種基礎上，分別接種0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.3%進行酒精發酵，按照1.5.1和1.5.2的方法測定酒精度和還原糖，確定酵母菌最佳接種量。

1.4.4 乳酸菌菌種的確定

在酵母菌菌種以及接種量確定的條件下，將一定量的嗜酸乳桿菌、保加利亞乳桿菌、長雙歧桿菌、嗜熱鏈球菌分別接入酶解液中，進行混合菌種發酵，按照1.5.1和1.5.2的方法測定酒精度和還原糖，確定乳酸菌的菌種[18]。

1.4.5 單因素試驗

1.4.5.1 乳酸菌接種量的單因素試驗

選擇酵母菌接種量0.2%，發酵溫度25 ℃，初始pH 4.4，設置乳酸菌的接種量分別為0.20%、0.16%、0.12%、0.08%、0.04%，測定酒精度和酸度，確定最佳乳酸菌接種量。

1.4.5.2 發酵pH值的單因素試驗

建立并實施分級診療制度，是實現“基層首診、雙向轉診、急慢分治、上下聯動”合理有序就醫新格局，合理醫療資源配置和促進基本醫療衛生服務均等化的重要措施。2015年9月國務院辦公廳印發了《關于推進分級診療制度建設的指導意見》，明確要求大力推行分級診療制度。2015年12月國家衛計委下發了《關于做好高血壓、糖尿病分級診療試點工作的通知》，明確了不同級別醫療機構的功能定位，將高血壓、糖尿病等慢性病作為分級診療試點開展先行工作。

在酵母菌接種量0.2%、乳酸菌接種量0.08%、發酵溫度25 ℃的條件下，設置pH梯度為3.6，3.9，4.0，4.2，4.4，4.6，測定發酵液中酒精度和還原糖，確定最佳發酵pH。

1.4.5.3 發酵溫度的單因素試驗

酵母菌接種量0.2%、乳酸菌接種量0.08%、發酵pH 4.4，調整發酵溫度分別為19，22，25，28，31 ℃，測定發酵液中的酒精度和還原糖，確定最佳發酵溫度。

1.4.6 響應面優化試驗設計

以單因素試驗的結果為基礎，以乳酸菌接種量(A)、發酵pH(B)、發酵溫度(C)3個因素進行Box-Behnken試驗設計，以酒精度作為響應指標，確定酒精發酵的工藝條件，響應面分析因素水平見表1[19]。

表1 響應面試驗設計各因素及水平Table 1 The factors and levels of response surface test design

1.5 測定方法

1.5.1 總糖、還原糖的測定

參考GB 5009.7-2016《食品安全國家標準 食品中還原糖的測定》第一法直接滴定法。

參考GB/T 15038-1994《葡萄酒、果酒通用試驗方法》酒精度第三法酒精計法。

用蒸餾法蒸餾，取100 mL發酵液于500 mL圓底燒瓶中，加入50 mL蒸餾水，放4顆沸石在水浴鍋中蒸餾，將蒸餾出的溶液定容到100 mL量筒中，將酒精計放入量筒中，同時用溫度計測量溫度，靜置5 min，讀取刻度線數值，記錄溫度，將讀取的數據按附錄進行溫度校正，得到20 ℃時發酵液的酒精度。

1.5.3 總酸的測定

參考GB/T 15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中總酸指示劑法。

2 結果與分析

2.1 酵母菌菌種及接種量的確定

根據1.4.3的試驗方法，酵母菌菌種及接種量的確定見圖1和圖2。

圖1 酵母菌種類對酒精發酵的影響Fig.1 Effect of yeast species on alcohol fermentation

由圖1可知，接入酵母菌RW的發酵液測出的酒精度為5.3%，還原糖為0.698%，而酵母SY蒸餾出的酒精度為4.1%，還原糖為0.828%，結果顯示：菌種RW發酵后酒精度比菌種SY的高，還原糖比菌種SY的低，利用發酵糖產酒能力強，所以選擇酵母RW。

圖2 酵母菌接種量對酒精發酵的影響Fig.2 Effect of yeast inoculation amount on alcohol fermentation

由圖2可知，當酵母菌的接種量在0.10%、0.20%、0.30%時，酒精度最高，都是5.6%，而三者的還原糖分別為0.763%、0.729%、0.739%，其中0.20%的還原糖最低，為0.729%，結合酒精度與還原糖殘糖量，故酵母菌的接種量選擇0.20%。

綜上所述，酵母菌選擇酵母RW，接種量為0.20%。

2.2 乳酸菌菌種的確定

根據1.4.4所示的試驗方法，乳酸菌的菌種選擇見圖3。

圖3 乳酸菌菌種對酒精發酵的影響Fig.3 Effect of lactic acid bacteria species on alcohol fermentation

由圖3可知，嗜酸乳桿菌、長雙歧桿菌、嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌4種菌種分別與酵母菌混合發酵后，結果顯示：嗜酸乳桿菌、長雙歧桿菌、嗜熱鏈球菌酒精發酵后的酒精度都是4.4%，而保加利亞乳桿菌的酒精度為4.5%，并且保加利亞乳桿菌發酵后的還原糖殘糖量最低，為0.589%，可明顯看出保加利亞乳桿菌的產酒能力優于其他3種乳酸菌，故乳酸菌的菌種選擇保加利亞乳桿菌。

2.3 單因素試驗結果分析

2.3.1 乳酸菌接種量對酒精發酵的影響

根據1.4.5試驗方法，乳酸菌接種量對酒精度的影響見圖4。

由圖4可知，乳酸菌接種量增加，發酵液的酒精度在不斷降低，乳酸菌接種量為0.04%和0.08%時，酒精度達到6.4%和6.3%，酸度分別為3.65%和3.71%。乳酸菌接種量為0.04%和0.08%時酒精度高，但接種量為0.08%時酸度最高，所以選擇乳酸菌的接種量0.08%。

2.3.2 初始pH對酒精發酵的影響

發酵pH對酒精度的影響見圖5。

圖5 發酵pH對酒精發酵的影響Fig.5 Effect of fermentation pH value on alcohol fermentation

由圖5可知，隨著pH值的升高，還原糖越來越低，酒精度越來越高，當pH為4.4時，還原糖達到最低點，酒精度達到最高點。當pH為4.4時，酒精度為6.35%，還原糖為0.568%，所以選pH 4.4為宜。

2.3.3 發酵溫度對酒精發酵的影響

發酵溫度對酒精度的影響見圖6。

由圖6可知，當溫度為25 ℃時，酒精度最高，為6.3%，還原糖含量為0.865%。所以選擇溫度25 ℃為最適宜條件。

圖6 發酵溫度對酒精發酵的影響Fig.6 Effect of fermentation temperature on alcohol fermentation

2.4 響應面優化試驗

以發酵液的酒精度為評價指標，在單因素的試驗基礎上，采用Box-Behnken法設計試驗，對乳酸菌接種量(A)、發酵pH(B)、發酵溫度(C)進行響應面優化試驗，試驗設計及結果見表2。

表2 試驗設計及結果Table 2 The test design and results

運用Design-Expert 8.0對表2試驗結果進行回歸分析，獲得乳酸菌接種量(A)、pH(B)、溫度(C)與酒精度(R)的二次多項回歸方程式：

R=6.02-0.22A-0.100B-0.025C+0.100AB+0.45AC+0.30BC-0.49A2-0.44B2-0.28C2。

對該響應面二次回歸模型進行方差分析, 結果見表3。

表3 響應面二次回歸方程模型方差分析結果Table 3 Response surface quadratic regression equation model results of variance analysis

顯著性試驗結果以P值大小表示，P值<0.05具有統計學意義。對模型進行方差分析，由表3可知，模型的P值<0.01，極顯著，可用于預測復合棗醋的最佳酒精發酵工藝。失擬項的P=0.6603>0.05，不顯著，說明誤差較小，預測的結果較可靠。模型的F值為10.61，說明模型具有顯著性。只有0.26%的幾率會因為噪音而出現如此大的“F值”。因此，可用此模型對復合棗醋酒精發酵的工藝條件結果進行分析和預測[21]。

由表3中方差分析結果可知，本試驗中二次項A2、B2、交互項AC對結果的影響極顯著；一次項A、二次項C2及交互項BC的P<0.05，表明對結果的影響顯著；B和C及交互項AB的P>0.05，說明B、C、交互項AB對酒精度的影響不顯著。

對酒精度影響的各因素交互作用見圖7。其中，乳酸菌接種量與發酵溫度的交互作用影響極顯著，發酵pH與發酵溫度的交互作用對酒精度的影響顯著，乳酸菌接種量與發酵pH的交互作用對酒精度無顯著影響。

由Design-Expert 8.0分析處理得到酒精發酵階段最佳發酵條件為：乳酸菌接種量0.07%，溫度24.38 ℃，pH 4.35，在此條件下，酒精度為6.127%。

2.5 響應面結果驗證試驗

根據響應面預測結果，對結果進行驗證試驗。驗證試驗中將最佳條件進行調整：乳酸菌接種量為0.07%，發酵pH為 4.3，發酵溫度為24 ℃，在此條件下測得酒精度為6.1%，與預測結果相接近。

3 結論

以山西省的壺瓶裂棗、沙棘為原料，通過單因素試驗、響應面試驗優化出復合棗醋酒精發酵階段的最佳發酵工藝：乳酸菌接種量0.07%，發酵pH 4.3，發酵溫度24 ℃，在此條件下，酒精度為6.1%。