響應面優化茶樹菇發酵調味料的制曲工藝

惠靖茹，程洋洋，黃占旺

(江西農業大學 食品科學與工程學院,江西省天然產物與功能食品重點實驗室，南昌 330045)

茶樹菇(Agrocybeaegerita)，又名茶新菇，是一種藥食兩用的真菌[1-2]。口感脆嫩清香，味道鮮美[3]；營養極其豐富，其蛋白質含量高達29.5%，含有多種人體必需氨基酸，以及多種B族維生素和礦物質元素[4-5]。此外，茶樹菇具有抗衰老[6]，免疫調節及抗腫瘤[7]，改善心腦血管功能[8]等天然優勢。目前茶樹菇主要分布在我國的福建、江西等地，江西省種植的茶樹菇產量在全國位居前列，但當地食用菌的加工技術不夠成熟，大多為產品單一且附加值低的初級加工產品[9]。因此，利用茶樹菇和成曲發酵制成具有豐富營養物質、口感鮮美的調味料，不僅可以提高茶樹菇的利用率而且使其深加工產品種類更加豐富。

米曲霉As3.042屬于黃曲霉群，菌落生長快，產孢能力強，可以更好適應環境，是傳統釀造食品級醬料和醬油的生產菌種[10-11]。由于米曲霉As3.042是一種產復合酶的菌種[12]，如蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶等[13]，其較高的酶活力可以更好地分解原料，且在一定程度上提高了醬類產品中的氨基酸態氮含量，進而更好地改善終產品的風味、色澤和口感[14]。

本文以米曲霉As3.042作為菌種，以糯米粉和黃豆粉作為菌種的營養物質并通過恒溫恒濕培養得到成曲。以蛋白酶活力、淀粉酶活力和纖維素酶活力作為評價指標進行單因素試驗，對在制曲過程中的顯著影響因素即原料質量比、潤水量和培養時間，依據Box-Behnken的中心組合試驗設計原理，以成曲中蛋白酶活力為響應值進行優化試驗，得到最佳的制曲工藝，并對試驗結果進行了驗證。

1 材料與方法

1.1 材料

米曲霉As3.042：濟寧玉園生物科技有限公司；糯米：江西撫州荊公農產品合作社；黃豆：贛州康瑞農產品有限公司。

1.2 試劑

干酪素(生物試劑)、3,5-二硝基水楊酸試劑(3,5-dinitrosalicylic acid, DNS)、福林酚：均為分析純，北京索萊寶科技有限公司；可溶性淀粉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、無水碳酸鈉、葡萄糖：均為分析純，西隴化工股份有限公司；羧甲基纖維素鈉(化學純)：上海展云化工有限公司。

1.3 儀器與設備

SPX-250B-Z型生化培養箱、立式壓力蒸汽滅菌器、SHZ-C水浴恒溫振蕩器 上海博訊醫療生物儀器股份有限公司；DHG-9140A電熱恒溫鼓風干燥箱 揚州市三發電子有限公司；FA2004G電子天平 常州萬泰太平儀器有限公司；酶標儀 Molecular Devices Corporation。

1.4 試驗方法

1.4.1 制曲工藝流程

糯米、黃豆→粉碎→過篩→干蒸→冷卻→接種→加入涼開水→拌勻→培養→成曲。

將原料粉碎過篩，置于蒸鍋中干蒸后，待糯米粉與黃豆粉于室溫下冷卻至40 ℃以下時，按照一定比例混合后接種米曲霉As3.042，拌勻。再加入一定量的涼開水拌勻后，置于托盤中壓平，切分成2 cm大小的方塊狀。放置霉菌培養箱中恒溫培養，平均每間隔12 h翻曲1次，利于米曲霉As3.042均勻生長進而提高成曲品質，直至制曲結束。

1.4.2 單因素試驗

設置原料質量比(糯米粉∶黃豆粉)、接種量、潤水量、培養時間和培養溫度5個影響因素，不同原料質量比(糯米粉的含量在原料總量中的占比為20%、40%、60%、80%、100%，即糯米粉∶黃豆粉為1∶4、2∶3、3∶2、4∶1、5∶0)、不同米曲霉接種量(0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%)、不同潤水量(加水量在原料總量中的占比為35%、45%、55%、65%、75%)、不同培養時間(24，36，48，60，72 h)、不同培養溫度(22，26，30，34，38 ℃)。依據1.4.1中的工藝流程進行制曲后，再將其置于電熱鼓風干燥箱中干燥，以成曲中的蛋白酶活力、淀粉酶活力和纖維素酶活力的大小為評價指標，考察以上5個因素對制曲過程的影響，確定單因素的最佳取值范圍。每個試驗平行進行3次，取其測量結果的平均值。

1.4.3 響應面優化試驗設計

培養成曲所需原料的總質量固定不變，原料質量比即糯米粉與黃豆粉的質量比，隨著糯米粉添加量的增多或減少，黃豆粉相應地減少或增多。因此在響應面試驗中，將原料質量比因素改為糯米粉添加量，通過單因素試驗所篩選的條件，選擇糯米粉添加量(A)、潤水量(B)、培養時間(C)3個因素為影響因素，每個因素設置3個水平，以蛋白酶活力為響應值，使用Design-Expert 8.0.6軟件進行響應面優化并確定最佳制曲工藝條件。試驗因素與水平見表1。

表1 響應面優化試驗因素水平表Table 1 The factors and levels of response surface optimization test

1.4.4 酶活力測定方法

中性蛋白酶活力的測定：參照SB/T 10317-1999《蛋白酶活力測定法》中的福林酚法；水分含量的測定：采用國標GB 5009.3-2016《食品安全國家標準 食品中水分的測定》中的常壓干燥法；淀粉酶活力和纖維素酶活力的測定：參考王海洋等[15]的方法。

1.4.5 數據分析

試驗數據的統計與分析采用SPSS 25.0軟件，響應面試驗設計、優化分析采用Design-Expert 8.0.6軟件，繪圖處理采用OriginPro 2018軟件。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 原料質量比對成曲中酶活力的影響

以糯米粉作為淀粉質原料，可為制曲時微生物的生長提供碳源，同時將黃豆粉作為蛋白質原料，為制曲過程中微生物的生長提供氮源。當具有充足的碳源和氮源時，微生物會迅速生長繁殖，代謝產物大大增加[16]。

圖1 原料質量比對3種酶活力的影響Fig.1 The effect of raw material mass ratio on the activity of three enzymes

由圖1可知，淀粉酶活力在原料質量比為2∶3時達到最大值，為255.95 U/g。而原料質量比為3∶2時，蛋白酶活力和纖維素酶活力均達到最大值，分別是4834.787, 17.1274 U/g。綜合考慮，選擇原料質量比(糯米粉∶黃豆粉)3∶2為最佳水平。

2.1.2 接種量對成曲中酶活力的影響

當接種量過小時，米曲霉對底物即原料利用不充分，導致酶活力較低；而隨著接種量的增加，原料中可利用的營養物質不足以滿足米曲霉自身生長需要，使得其中部分微生物由于養分不足而生長緩慢，并影響了最終菌種孢子的成熟，其蛋白酶、淀粉酶和纖維素酶等酶系的分泌量也隨之減少，進而導致其酶活力降低[17]。王瑩[18]通過對米曲霉As3.042在醬油釀造中的性能檢測，發現米曲霉As3.042具有較高的蛋白酶活力，可以更好分解蛋白質含量較多的原料，且采用米曲霉As3.042制曲時，其中的酯類物質含量較高，醬油的酯香濃郁，香氣綿長飄逸。

由圖2可知，當接種量為0.3%時，米曲霉生長所需的碳源和氮源充足，蛋白酶活力、淀粉酶活力和纖維素酶活力均達到最大值，分別為4979.43, 244.87, 14.75 U/g。所以，接種量的最佳條件為0.3%。

圖2 米曲霉接種量對3種酶活力的影響Fig.2 The effect of Aspergillus oryzae inoculation amount on the activity of three enzymes

2.1.3 潤水量對成曲中酶活力的影響

在微生物的生長過程中，水不僅直接參與微生物的代謝反應，還作為介質存在其中。米曲霉通過孢子繁殖，而孢子在生長過程中需要吸入一定量的水分使其膨脹，有利于加快米曲霉的生長速度。此外，微生物代謝產物溶解到水中，才能通過細胞表面釋放出來。同時，當基質水分含量過高時，會造成基質缺氧，不利于米曲霉生長[19]。

由圖3可知，隨著潤水量的增加，3種酶活力呈現先增后減的趨勢。當潤水量達到55%時，蛋白酶活力、淀粉酶活力和纖維素酶活力均達到最大值，分別為4696.97, 218.95, 20.10 U/g。因此，選擇55%為最佳潤水量。

圖3 潤水量對3種酶活力的影響Fig.3 The effect of water quantity on the activity of three enzymes

2.1.4 培養溫度對成曲中酶活力的影響

成曲中的酶活力具有高度的溫度依賴性。低溫對酶具有鈍化作用，會減緩微生物的生長及產物的代謝，降低酶活力；當溫度超過38 ℃時，3種酶活力都趨于平緩，這是因為溫度過高不利于微生物的生長及代謝，甚至會導致酶失活。因此在制曲過程中，對培養溫度的選擇尤為重要[20]。

由圖4可知，當溫度達到30 ℃時，蛋白酶活力和纖維素酶活力均達到最大值，分別為4624.95, 14.00 U/g；而在34 ℃時，淀粉酶活力達到最大值，為247.70 U/g。綜合考慮，選擇30 ℃為最佳培養條件。

圖4 培養溫度對3種酶活力的影響Fig.4 The effect of cultivation temperature on the activity of three enzymes

2.1.5 培養時間對成曲中酶活力的影響

制曲時間對成曲的品質有較大影響。當制曲時間較短時，微生物不能充分生長，酶活力較小，成曲的風味不足；而制曲時間過長，微生物進入衰亡期，會使其他雜菌生長，導致成曲中酶活力減小，影響發酵階段的產品品質[21]。

由圖5可知，當培養時間達到48 h時，成曲中蛋白酶活力、淀粉酶活力和纖維素酶活力均達到最大值，分別為4668.38, 217.30, 12.67 U/g。因此，以48 h作為最佳培養時間。

圖5 培養時間對3種酶活力的影響Fig.5 The effect of cultivation time on the activity of three enzymes

2.2 響應面試驗結果及分析

2.2.1 響應面試驗設計與結果

綜合單因素試驗結果，固定米曲霉接種量0.3%、培養溫度30 ℃，篩選出對制曲過程影響較大的3個因素，即原料質量比(A)、潤水量(B)和培養時間(C)，以蛋白酶活力(Y)為響應值，進行響應面優化試驗，設計方案及結果見表2。

表2 響應面試驗設計與結果Table 2 Response surface test design and results

根據Box-Behnken中心復合設計原理，建立回歸方程預測模型，對響應面試驗的結果進行多元線性回歸和二項擬合分析，得到回歸方程為： Y=5048.60+846.74A-363.33B-1.21C+48.35AB+27.79AC+44.41BC-1396.00A2-812.27B2-881.92C2。

2.2.2 模型方差分析

利用軟件Design-Expert 8.0.6建立模型，得到蛋白酶活力的多元二次回歸響應面模型，對試驗結果進行多元線性回歸和二項擬合分析，以驗證回歸模型與因素的顯著性。方差分析結果見表3。

表3 回歸模型方差分析表Table 3 The variance analysis of regression model

由表3可知，建立的回歸模型中F=72.01，P<0.0001，表明回歸模型的差異極顯著；而失擬項的P為0.5825>0.05，模型差異不顯著，表明該方程可靠；回歸系數R2=98.93%>85%，說明該方程擬合程度好，可用該回歸方程代替試驗真實點，來描述各變量與響應值之間的關系。校正系數RAdj2=0.9756，說明該模型可解釋97.56%蛋白酶活力的變化。表3中數據表明試驗設計可靠，誤差小，適合實際情況，可用來對茶樹菇發酵調味料的制曲試驗結果進行分析和預測。

由表3中P值可知,一次項中原料質量比(A)和潤水量(B)對蛋白酶活力的影響極顯著，培養時間(C)的影響不顯著；二次項中A2、B2和C2對蛋白酶活力的影響均為極顯著；交互項中AB、AC、BC對蛋白酶活力的影響均為不顯著。參照表3中F值的大小可得出結論：3個因素對成曲中蛋白酶活力的影響程度為原料質量比(A)>潤水量(B)>培養時間(C)。

2.2.3 各因素交互作用的響應面圖與等高線圖

響應曲面圖可以直觀地體現兩變量對因變量的影響情況，其坡度越陡峭，說明該試驗中的因變量對響應值的影響越大，若曲面坡度越平緩，則影響越小；等高線圖呈橢圓形時，表明兩變量之間的交互作用越顯著，若等高線圖趨近圓形，則兩變量的交互作用幾乎可忽略[22]。利用響應面回歸模型創建的原料質量比、潤水量、培養時間的交互效應響應面圖及等高線圖見圖6。

a1

將其中一個因素固定，考察其他2個因素對響應值的影響。由圖6中a1和a2可知，在固定因素培養時間(C)的情況下，隨著糯米粉添加量和潤水量的提高，蛋白酶活力呈先升高后降低的趨勢。在糯米粉含量為58.4%～73.9%，潤水量為47.8%～57.9%時，蛋白酶活力在較高范圍內。由圖6中b1和b2可知，在固定因素潤水量(B)的情況下，隨著糯米粉添加量和培養時間的增加，蛋白酶活力呈先升高后降低的趨勢。在糯米粉添加量為59.3%～73.2%，培養時間為42.7～53.3 h時，蛋白酶活力處于較高水平。由圖6中c1和c2可知，在固定因素糯米粉添加量(A)的情況下，隨著潤水量和培養時間的增加，蛋白酶活力亦是先升高后降低的趨勢。在潤水量為49.7%～55.8%，培養時間為44.4～51.5 h時，蛋白酶活力較高。

2.2.4 驗證試驗

對回歸擬合方程進行求解，得出最佳制曲條件：A=66.13，B=52.85，C=47.98，此條件下，預測蛋白酶活力為5219.89 U/g。根據試驗和實際操作可行性，調整修正后的茶樹菇調味料制曲條件：糯米粉為66%，即原料比(糯米粉∶黃豆粉)為3.3∶1.7，接種量為0.3%，潤水量為52.9%，培養時間為48 h，培養溫度為30 ℃。

在此條件下進行驗證試驗，得到茶樹菇調味料成曲的蛋白酶活力為5118.16 U/g，同模型預測值的相對誤差僅為1.95%(<5%)，說明響應面法對茶樹菇調味料制曲的工藝條件優化所得到的生產工藝參數準確可靠，具有一定應用價值。

3 結論

調味料的科學調味營養化、多樣化和高檔化是未來調味料發展的趨勢。以蛋白酶活力、淀粉酶活力、纖維素酶活力的大小為指標，通過單因素試驗，在所得結果的基礎上，采用響應面法優化確定了茶樹菇發酵調味料的最優制曲工藝：原料質量比(黃豆粉∶糯米粉)為3.3∶1.7，接種量為0.3%，潤水量為52.9%，培養溫度為30 ℃，培養時間為48 h。在該條件下所制得成曲中的蛋白酶活力為5118.16 U/g，酶系含量較高，將其切為2 cm大小的方塊狀，表面與切面均長滿黃綠色孢子，具有成曲特殊的清香味，無雜菌生長。本研究可為用成曲與茶樹菇為原料制備發酵調味料的工藝研究提供一定的理論基礎，同時對發酵過程中相關理化指標的檢測提供了科學的試驗依據。