酸筍中高產甘露醇異型發酵乳酸菌的篩選及其發酵性能

盧宏皓，劉昭明，黃翠姬，虞珂娜，萬堃華

(廣西科技大學 生物與化學工程學院，廣西 柳州 545006)

異型發酵乳酸菌(heterofermentative lactic acid bacteria)是指能夠進行異型發酵代謝[1]，除生成乳酸外還生成CO2、乙醇和甘露醇等多種物質的乳酸菌。與同型發酵乳酸菌(homofermentative lactic acid bacteria)相比，異型發酵乳酸菌生成的乳酸相對較少，但是由于其可以生成甘露醇、乙醇等風味物質，賦予發酵產品更好的風味與口感，所以異型發酵乳酸菌被認為是更好的蔬菜腌制的發酵菌種[2]。有研究表明，使用乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)和檸檬明串珠菌(Leuconostoccitreum)混合發酵韓國泡菜，改善了泡菜的風味特性，延長了泡菜的貨架期[3]；在韓國泡菜發酵中采用檸檬明串珠菌(Leuconostoccitreum)進行發酵可以提高產品的品質。異型發酵乳酸菌可以增加發酵食品的風味，與其發酵過程中生成的代謝產物甘露醇密切相關。Choi等[4]研究發現模式泡菜的感官偏好與甘露醇濃度呈正相關；云琳等[5]認為甘露醇是蘿卜泡菜的特征性風味物質，具有清爽的甜味。

異型發酵乳酸菌是發酵法生產甘露醇的優良菌株[6]，因此有關優良異型發酵乳酸菌的分離鑒定與發酵性能研究是其應用于改善發酵食品風味的基礎。發酵酸筍是以竹筍為原料經發酵制得的發酵食品，為柳州螺螄粉的重要配菜，是形成螺螄粉獨特“酸爽”風味的重要食材，而風味物質的形成依賴于異型乳酸菌的代謝。長期以來，酸筍的生產主要以小作坊的自然發酵法為主要模式，其產品質量及安全性難以保證。目前，就我們所知，國內尚未見到有從酸筍中分離異型乳酸菌的報道。為了獲得適用于酸筍接種發酵的異型乳酸菌，本研究以甘露醇為指標，從自然發酵酸筍中篩選出產甘露醇的異型乳酸菌，并對其性能進行研究，為異型乳酸菌接種發酵酸筍提供了指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

竹筍：購自廣西柳州市區桂中菜市場。

MRS液體培養基：蛋白胨10 g，酵母膏4 g，牛肉膏5 g，檸檬酸三銨2 g，葡萄糖20 g，吐溫80 1 mL，無水乙酸鈉5 g，磷酸氫二鉀2 g，硫酸鎂0.2 g，硫酸錳0.05 g，蒸餾水1000 mL，pH 6.5±0.2。

MRS固體培養基：在MRS液體培養基中添加2%(W/V)瓊脂粉。

MRS選擇培養基：在MRS液體培養基中額外添加2%(W/V)果糖。

引物27F/1492R：北京索萊寶科技有限公司；EB替代染料：北京普利萊基因技術有限公司；TBE buffer、2×Taq PCR MasterMix II、去離子水：天根生化科技有限公司。

其余化學試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

E220雙目生物光學顯微鏡 麥克奧迪實業集團有限公司；H3-18KR臺式高速冷凍離心機 湖南可成儀器設備有限公司；P3PC紫外可見分光光度計 上海美譜達儀器有限公司；TC-XP-G XP基因擴增儀 杭州博日科技有限公司；LRH-250生化培養箱 廣東省醫療器械廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 產甘露醇乳酸菌的分離與鑒定

1.3.1.1 酸筍發酵

將鮮筍剝皮，清洗干凈，切分成長約4 cm、寬約3 cm、厚約0.5 cm的片狀，自然晾干后裝入2 L發酵瓶中(裝瓶量為容積的1/2)，然后加入涼白開水浸沒過鮮筍表面，封蓋自然發酵。

1.3.1.2 乳酸菌初篩

初篩的目的是從酸筍發酵液中分離純化出具有乳酸菌特征的菌株。因此，取第1，3，5天的酸筍發酵液各1 mL，用生理鹽水進行10倍梯度稀釋，采用傾注法[7]取適宜梯度的樣品稀釋液1 mL混勻于含有2% CaCO3的MRS平板上，30 ℃培養48 h，同時接種1 mL生理鹽水作為空白對照。從平板中挑取有明顯溶鈣圈的單菌落接種于新的MRS平板進行分離純化，純化3～4代，將分離純化所得的革蘭氏染色陽性、過氧化氫接觸酶陰性的菌株轉接于斜面，30 ℃培養48 h后于4 ℃保藏[8]。

1.3.1.3 乳酸菌復篩

復篩的目的是從初篩得到的乳酸菌菌株中篩選具有產甘露醇能力的異型發酵乳酸菌。將初篩獲得的菌株接入MRS液體培養基中30 ℃培養24 h，連續活化2次后按1%(V/V)接種于MRS選擇培養基中繼續培養24 h后取1.5 mL發酵液經離心機離心(4 ℃，10000 r/min，10 min)，取上清液，采用改進的高碘酸鈉氧化法測定其中甘露醇含量[9]。收集甘露醇產量大于18 g/L的異型發酵乳酸菌菌株。

1.3.1.4 分子生物學鑒定

將獲得的目標菌株接種于MRS液體培養基中，30 ℃培養24 h，8000 r/min離心2 min，棄上清液，收集離心到的菌體并以其為模板，利用細菌通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R (5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)擴增細菌16S rDNA基因。在50 μL的反應體系中加入DNA模板2 μL，27F引物1 μL，1492R引物1 μL，2×Taq PCR MasterMix II 10 μL，ddH2O 6 μL。

PCR擴增條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共30個循環；72 ℃再延伸10 min。

PCR擴增產物送交華大基因公司進行16S rDNA測序，所得序列在NCBI中進行比對，確定菌株，采用MEGA 7.0構建系統發育樹。

1.3.2 異型發酵乳酸菌生長曲線的測定

將獲得的高產甘露醇菌株于30 ℃培養24 h后按1%(V/V)接種于MRS液體培養基中培養，每3 h取菌液適當稀釋后測定其在波長600 nm處的吸光度值，繪制乳酸菌的生長曲線。

種子液制備：取供試菌種接種至MRS液體培養基中，30 ℃培養24 h，然后取1%(V/V)發酵液接種于新的MRS液體培養基中繼續培養12 h作為種子液。

1.3.3 異型發乳酸菌產酸能力的測定

在MRS液體培養基中接入1%(V/V)的種子液，30 ℃培養24 h后取發酵液經離心后測定總酸含量。總酸含量的測定參照GB/T 12456-2008《食品中總酸的測定》，含量以乳酸計。

1.3.4 異型發酵乳酸菌降解亞硝酸鹽能力的測定

在已滅菌的含有10 μg/mL亞硝酸鈉的MRS液體培養基中接入1%(V/V)的種子液，30 ℃培養24 h。

將發酵液離心后取1 mL上清液置于100 mL容量瓶中，加入2.5 mL 50 g/L飽和硼砂溶液,加入70 ℃左右的水約50 mL，混勻，于沸水浴中加熱 15 min，取出置于冷水浴中冷卻，并放置至室溫。加入1 mL 106 g/L亞鐵氰化鉀溶液，搖勻，再加入1 mL 220 g/L乙酸鋅溶液,以沉淀蛋白質。加水至刻度，搖勻，放置30 min，除去上層脂肪，上清液用濾紙過濾,棄去初濾液15 mL，濾液備用。

亞硝酸鹽的測定方法參照GB 5009.33-2016《食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》。

1.3.5 異型乳酸菌產甘露醇特性實驗

1.3.5.1 果糖濃度與菌株產甘露醇的關系

將MRS液體培養基中的葡萄糖換成果糖，使培養基中果糖終濃度分別為20，40，60，80，100 g/L。在不同果糖濃度的培養基中分別接入1%(V/V)種子液，30 ℃培養48 h后取發酵液經離心后測定甘露醇含量。

1.3.5.2 pH值與菌株產甘露醇的關系

MRS發酵培養基：根據1.3.5.1的結果選擇最優果糖含量的MRS果糖培養基，調節pH值為5.0，6.0，7.0。

根據1.3.3～1.3.5.1的結果選擇發酵性能最優的菌株，在不同pH值的MRS發酵培養基中接入1%(V/V)的種子液，30 ℃培養48 h，以不接種的果糖培養基作為對照組，以蒸餾水為空白并分別在0，8，24，48 h測定pH值、乳酸菌總數、甘露醇及總酸含量。

1.4 統計學分析

每組3個平行試樣，數據表示為平均值±標準差形式。使用SPSS 22.0進行數據分析，采用ANOVA進行顯著性分析，顯著水平P<0.05，以不同字母表示，利用Microsoft Office Excel 2010、Origin 9、MEGA 7.0軟件進行數據計算和圖形制作。

2 結果與討論

2.1 高產甘露醇異型發酵乳酸菌的分離篩選

從自然發酵酸筍中共分離、純化得到108株菌株，經革蘭氏染色和過氧化氫酶試驗，共得到61株革蘭氏染色為陽性、過氧化氫為陰性的菌株，分別編號為1～61號，部分菌株的菌體形態見圖1。將初篩獲得的菌株在選擇培養基中培養發酵，取其發酵液與高碘酸鈉試劑反應，測定發酵液顏色變化較深的6株菌株的甘露醇含量，結果見圖2。

圖1 部分菌株的菌體形態Fig.1 The mycelial morphology of some strains

圖2 甘露醇產量

由圖2可知，3號、11號、12號菌株的甘露醇產量較高，產量達18 g/L以上，分別為18.43，18.30，18.03 g/L，其余菌種的甘露醇產量相對較低，達不到18 g/L，故棄去。選取3號、11號、12號菌株進行后續實驗測定。

2.2 異型發酵乳酸菌生長動力學

測定3號、11號、12號 3株異型發酵乳酸菌的生長曲線，結果見圖3。

圖3 乳酸菌生長曲線Fig.3 The growth curves of lactic acid bacteria

由圖3可知，3株菌在0～3 h生長緩慢，為生長延滯期，在3 h后生長迅速，3～12 h為對數生長期，此時乳酸菌迅速生長繁殖，在12 h時OD值達到高峰并保持相對穩定，此時，活菌數不再增加，進入生長穩定期。3株菌均在12 h進入對數生長末期，處于對數生長期的菌種活性最高，此時接種可使菌體活性最高，所以種子液培養時間選擇12 h。

2.3 異型發酵乳酸菌的發酵性能

2.3.1 產酸能力

通常，異型發酵乳酸菌在發酵過程中的產酸能力不如同型乳酸菌，但是其產酸能力仍然是重要的發酵性能指標，產酸能力強，有利于抑制雜菌的生長，提高產品的安全性[10]。3號、11號、12號3株異型發酵乳酸菌的產酸能力測定結果見圖4。

圖4 培養24 h乳酸菌產酸量Fig.4 The acid yield of lactic acid bacteria cultured for 24 hours

由圖4可知，培養24 h后，3株菌的產酸量分別為6.68，6.86，6.81 g/L，是具有較好產酸能力的優良菌株。本研究的結果高于孔彥卓等[11]從豆清發酵液中分離的高產酸腸膜明串珠菌，其產酸量低于6 g/L。

2.3.2 降解亞硝酸鹽能力

在竹筍腌制的過程中，同其他腌制蔬菜一樣，極易產生亞硝酸鹽，對人體有潛在的危害。長期食用含大量亞硝酸鹽的食品，會引發致癌甚至死亡的危險。使用乳酸菌降解亞硝酸鹽含量具有重要意義[12]。3號、11號、12號亞硝酸鹽降解量見圖5。

圖5 乳酸菌降解亞硝酸鹽能力Fig.5 The degradation ability of lactic acid bacteria on nitrite

由圖5可知，培養液中3株菌亞硝酸鈉剩余量分別為2.55，2.68，1.94 μg/mL，其中12號菌株的降解能力最強，亞硝酸鹽降解率為79.05%。高于相同培養時間下孟憲剛等[13]分離得到的乳酸菌亞硝酸鹽降解率(5%～60%)。

2.4 異型乳酸菌產甘露醇的能力

2.4.1 果糖濃度對甘露醇產量和轉化率的影響

異型乳酸菌通過利用甘露醇脫氫酶將果糖轉化為甘露醇等有利的代謝產物，改善風味，還能降低食品中糖含量，適于肥胖和糖尿病等人群食用。甘露醇產量和果糖轉化率見表1。

表1 甘露醇產量及果糖轉化率Table 1 The mannitol yield and fructose conversion rate

由表1可知，果糖濃度從20 g/L到60 g/L，所有分離株的甘露醇產量都有大幅度增加。其中12號菌株在40 g/L果糖濃度下的甘露醇含量最高(21.90 g/L)，果糖轉化率為54.75%。隨著果糖濃度從60 g/L增加到100 g/L，所有菌株的甘露醇產量開始下降，只有12號菌株在100 g/L果糖濃度下其甘露醇產量超過40 g/L，這說明12號菌株是比較優良的產甘露醇的菌株，后面對其進行進一步的研究。

2.4.2 初始pH值對果糖發酵的影響

12號菌株在不同初始pH值的培養基中甘露醇產量、總酸、pH值以及乳酸菌總數見圖6和圖7。

圖6 不同初始pH條件下12號乳酸菌的pH值及乳酸菌生長計數Fig.6 The pH value and growth count of No.12 Lactobacillus under different initial pH values

圖7 不同初始pH條件下12號乳酸菌的甘露醇及總酸產量Fig.7 The mannitol and total acid yield of No.12 Lactobacillus under different initial pH values

由圖6和圖7可知，在初始pH為5，6，7的條件下，12號菌株都能利用果糖生產甘露醇，且在pH 5的條件下培養48 h獲得了最高甘露醇產量(22.98 g/L)、最低pH值(4.03)和最高總酸含量(1.31%)。

當果糖是唯一的碳源時，異型乳酸發酵可將果糖還原為甘露醇，最大理論產率約為67%。12號菌在初始pH 5的條件下發酵48 h甘露醇產量最高，為22.98 g/L，其產率達到57.45%，而在初始pH為6和7時甘露醇得率分別為55.48%、50.45%，較初始pH為5時甘露醇得率低，說明適當降低初始pH可提高分離株的甘露醇產量。Saha等[14]研究發現中間乳桿菌產甘露醇的最佳pH值為5。Yue等[15]研究發現，采用兩段pH控制(即前12 h pH 5.5，其余發酵時間pH 4.5)可以提高短乳桿菌的甘露醇產量。

在6.45 log CFU/mL的接種量時開始發酵，不同pH條件下培養基中乳酸菌總數在發酵前8 h增長迅速，且以初始pH 7的乳酸菌增量最大，在8 h時達到9.11 log CFU/mL，說明不同初始pH值可以影響初始乳酸菌數量的增加[16]。隨著發酵過程的進行，pH降低，乳酸菌含量在8 h后減少。

2.5 乳酸菌16S rDNA基因序列分析

將12號菌株所得序列在NCBI中進行比對，采用MEGA 7.0構建系統發育樹，見圖8。

圖8 基于16S rDNA序列12號乳酸菌株的系統發育樹Fig.8 The phylogenetic tree of No.12 Lactobacillus based on 16S rDNA sequence

Romi Wahengbam等[17]通過對竹筍發酵進行連續7 d的微生物群落結構和種群動態分析，發現在發酵早期(1～3 d)存在較多Leuconostoccitreum、Weissellacibaria等異型乳酸菌。由圖8可知，12號菌株與Leuconostoccitreum聚于一支，同源性均在99%以上，因此被鑒定為檸檬明串珠菌，將12號菌株命名為檸檬明串珠菌NM-12(LeuconostoccitreumNM-12)。

3 結論

本研究從自然發酵酸筍中共分離得到61株乳酸菌，通過復篩及性能測定，選出一株高產甘露醇乳酸菌，經分子生物學鑒定，該菌株為檸檬明串珠菌，命名為檸檬明串珠菌NM-12(LeuconostoccitreumNM-12)。通過對其發酵性能測試可知，LeuconostoccitreumNM-12菌株的產酸量為6.81 g/L，亞硝酸鈉降解率為79.05%，在pH 5、果糖含量為40 g/L的條件下30 ℃培養48 h，其甘露醇產量為22.98 g/L，最大果糖轉化率為57.45%。