(+)-4-萜品醇對蠟樣芽孢桿菌混菌生物膜的清除及與微酸性電解水協同作用研究

田雪，趙麗君，莫曉慧，段飛霞,2*

(1.四川大學 輕工科學與工程學院，成都 610065；2.食品科學與技術四川省高校重點實驗室，成都 610065)

細菌生物膜是菌體細胞聚集、附著在固體表面或氣液界面而形成的生物活性基質[1]；對鹽濃度、干燥、高溫、抗生素、滅菌劑和食品防腐劑具有高度的耐受性[2]。食源性病原菌蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)極易污染米飯、乳品、豆制品、果蔬表面及禽畜產品，在各類食品中均有檢出，某些亞群可產生耐高溫嘔吐毒素[3]，引發嚴重的食物中毒和食品腐敗[4-6]。蠟樣芽孢桿菌易形成高抗性、難清除的生物膜，是導致加工中反復交叉污染和加工后污染的主要原因[7-8]?，F有研究表明，含氯消毒劑，如次氯酸鈉、季銨鹽等，與高壓水清洗聯用，尚不能有效清除蠟樣芽孢桿菌生物膜，且易損傷食品原料，產生消毒劑殘留，增加微生物耐藥風險，亟待研究新的菌膜清除策略[9]。

微酸性電解水(SAEW)，是刺激性相對較低的含氯消毒劑，用于食品及醫藥工業[10-11]。植物香料天然精油是抗菌和抗細菌生物被膜的潛在資源[12]。(+)-4-萜品醇為含氧單環單萜化合物，呈清淡的木香味，是羅勒、牛至、香葉等香料及茶樹精油的重要組分[13]。含(+)-4-萜品醇植物精油多具有抑菌活性，但(+)-4-萜品醇單體化合物的抑菌和清除細菌生物膜作用尚不明確[14]。

本文采用結晶紫法等研究了(+)-4-萜品醇對蠟樣芽孢桿菌等多種食源性病原菌的抑菌作用和生物膜清除能力，探究其與SAEW的協同作用；采用場發射掃描電鏡(FESEM)，觀察(+)-4-萜品醇和SAEW對常見食品加工接觸表面蠟樣芽孢桿菌混菌生物膜的清除及對微觀結構的影響，為探索安全、高效、低殘留的混菌生物膜清除方法提供了理論依據和數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料

肉湯培養基、胰蛋白大豆肉湯培養基；聚氨酯板(PU)：規格10 mm×10 mm；聚氯乙烯(PVC)：規格10 mm×10 mm；(+)-4-萜品醇：CAS號2438-10-0；SAEW：有效氯濃度高于120 μg/mL。

1.2 菌種

蠟樣芽孢桿菌(BacilluscereusATCC 14579)、鼠傷寒沙門氏菌(SalmonellatyphimuriumATCC 14028)、大腸桿菌(EscherichiacoliATCC 25922)、銅綠假單胞菌(PseudomonasaeruginosaATCC 27853)、阪崎克羅諾桿菌(CronobactersakazakiiATCC 29544)、金黃色葡萄球菌(StaphylococcusaureusATCC 6538)：購自ATCC美國典型生物資源保藏中心。

1.3 菌種培養

LB肉湯、胰蛋白大豆肉湯培養基于121 ℃滅菌15 min備用；蠟樣芽孢桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌、阪崎腸桿菌、金黃色葡萄球菌接種后于37 ℃恒溫培養至對數生長期。

1.4 最低抑菌濃度測定

按照馮林慧等[15]的方法測定不同濃度(+)-4-萜品醇、SAEW及二者聯用時不同細菌的生長情況。吸取對數生長期不同菌液，用無菌TSB接種于96孔板中，接種濃度按麥氏比濁度0.05計，分別加入0～128 μmol/mL (+)-4-萜品醇、0～96 μg/mL SAEW，37 ℃恒溫培養24 h，采用酶標儀在600 nm處測定各孔吸光度值[16]。對照及每個濃度組均設置3組平行，重復3次實驗[17]。

1.5 生物膜的清除

按照柴旭鋒等[18]的方法清除已形成的生物膜。聚氨酯、聚氯乙烯小塊滅菌后，用95%乙醇淋洗3～5次待用。吸取對數生長期菌液分別接種于96孔板和6孔板中，接種濃度按麥氏比濁度0.05計，6孔板中放入聚氨酯、聚氯乙烯小塊，96孔板置于37 ℃恒溫培養48 h，6孔板培養72 h后，各孔加入不同濃度的(+)-4-萜品醇、SAEW和采用SAEW溶解的(+)-4-萜品醇溶液，暗室靜置30 min。96孔板中各孔輕輕吸去自由漂浮的細胞及培養液，用無菌PBS緩沖液清洗2次，使其風干待測。取出6孔板中聚氨酯、聚氯乙烯小塊，待測。

1.6 結晶紫法測定菌膜殘留量

按照張君怡等[19]的方法測定菌膜殘留量。向每孔中加入200 μL甲醇固定15 min，倒扣傾出甲醇，風干后每孔加入200 μL 0.10%的結晶紫染色液，染色15 min，用無菌PBS緩沖液洗滌3次并風干；每孔加入200 μL 33% 冰乙酸，靜置5～15 min。使用酶標儀測定570 nm處的吸光度[20]。對照及每個濃度組均設置3組平行，重復3次實驗。

1.7 FESEM觀察

將1.5中聚氨酯、聚氯乙烯小塊置于2.5%戊二醛的溶液中，在4 ℃下固定15 h，用無菌水洗滌、晾干，用乙醇溶液(10%、30%、50%、70%、90%和95%)梯度脫水處理，各梯度脫水15 min后風干。樣品置于高真空蒸發器中，噴金鍍膜，用場發射掃描電鏡觀察細菌生物膜的形態結構。

1.8 統計與數據分析

所有實驗重復測定3次，取平均值進行數據分析，標準差在各圖中用誤差線表示。采用Origin 8.0 軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 (+)-4-萜品醇抑菌作用

不同濃度(+)-4-萜品醇作用下，常見食源性病原菌革蘭氏陽性(G+)菌蠟樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌及革蘭氏陰性(G-)菌大腸桿菌、銅綠假單胞菌、阪崎腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌的生長情況見圖1。

圖1 (+)-4-萜品醇作用下蠟樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、阪崎腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌和銅綠假單胞菌的生長情況Fig.1 The growth situations of B. cereus, S. aureus, E. coli, C. sakazakii, S. typhimurium and P. aeruginosa in the presence of (+)-4-terpineol

由圖1可知，(+)-4-萜品醇對G+菌和G-菌都具有顯著的抑菌作用，對蠟樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、阪崎腸桿菌生長的抑制作用顯著，其最低抑菌濃度(MIC)為8 μmol/L；對鼠傷寒沙門氏菌生長的抑菌濃度最好，其MIC為2 μmol/L，對銅綠假單胞菌的MIC為128 μmol/L。

2.2 (+)-4-萜品醇與SAEW的協同抑菌作用

2.2.1 對純培養食源性病原菌的協同抑菌作用

(+)-4-萜品醇與SAEW對6種純培養食源性病原菌的生長抑制的協同作用見圖2。

由圖2可知，0～96 μg/mL的SAEW對細菌生長的抑制作用隨著處理濃度的增加而逐漸增強。96 μg/mL的SAEW對蠟樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、阪崎腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌和銅綠假單胞菌生長的抑制率分別為36%、48%、35%、30%、37%和40%。

采用4 μmol/mL(1/2 MIC)(+)-4-萜品醇與SAEW同時處理時，96 μg/mL的SAEW對上述細菌生長的抑制率提高到85%、84%、59%、56%、90%和42%；其中，對蠟樣芽孢桿菌和鼠傷寒沙門氏菌的協同抑菌效果最佳。6 μmol/mL的(+)-4-萜品醇單獨作用，可完全抑制大腸桿菌和蠟樣芽孢桿菌的生長，與12 μg/mL的SAEW協同作用即可完全抑制金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌和阪崎腸桿菌的生長。8 μmol/mL的(+)-4-萜品醇完全抑制了銅綠假單胞菌以外的其他5種食源性病原菌，與SAEW同時處理對銅綠假單胞菌生長的抑制作用也不顯著，可能與(+)-4-萜品醇自身的抑菌作用特點有關。

上述實驗結果表明，SAEW在0～96 μg/mL的濃度范圍內不能完全抑制蠟樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、阪崎腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌和銅綠假單胞菌單一菌種培養物的生長；(+)-4-萜品醇與SAEW存在協同抑菌作用，對蠟樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和鼠傷寒沙門氏菌生長的協同抑制作用最為顯著。

2.2.2 對混菌生長的協同抑制作用

(+)-4-萜品醇與SAEW對蠟樣芽孢桿菌混菌生長抑制的協同作用見圖3。

由圖3可知，單獨使用微酸性電解水作用于混菌時，隨著SAEW濃度的增大，混菌的生長受到一定程度的抑制，96 μg/mL的SAEW對蠟樣芽孢桿菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌、阪崎腸桿菌、金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌及6種菌混合培養物生長的抑制率分別為32%、36%、34%、29%、25%和36%，略低于對單一培養物的抑制率。

采用6 mmol/L的(+)-4-萜品醇與不同濃度SAEW同時處理，達到上述程度抑制率所需SAEW的濃度下降為12，24，12，36，0，24 μg/mL；完全抑制蠟樣芽孢桿菌、大腸桿菌、阪崎腸桿菌、金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌及6種混菌培養物的生長所需SAEW濃度分別為96，84，96，24，96 μg/mL。(+)-4-萜品醇的濃度為8 μg/mL時，可完全抑制蠟樣芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌及6種菌混合培養物的生長，與12 μg/mL的SAEW同時處理能夠完全抑制蠟樣芽孢桿菌與阪崎腸桿菌混菌的生長。

上述實驗結果表明，0～96 μg/mL的SAEW不能完全抑制蠟樣芽孢桿菌混菌的生長；(+)-4-萜品醇與SAEW對蠟樣芽孢桿菌混菌的生長同樣具有協同抑制作用，但作用濃度略高于單一培養物，對蠟樣芽孢桿菌與鼠傷寒沙門氏菌混菌生長的抑制作用最為顯著。

2.3 (+)-4-萜品醇對細菌生物膜的清除作用

(+)-4-萜品醇、SAEW對96孔板中培養48 h后的各類細菌生物被膜的清除作用見圖4中A和B。(+)-4-萜品醇在8～16 μmol/mL濃度下，對蠟樣芽孢桿菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌、阪崎腸桿菌、金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌的清除作用隨著濃度的增加而增強；8 μmol/mL和16 μmol/mL的(+)-4-萜品醇對上述單一菌種菌膜的清除率分別為：蠟樣芽孢桿菌21%、51%；大腸桿菌77%、81%；銅綠假單胞菌37%、48%；阪崎腸桿菌26%、57%；金黃色葡萄球菌40%、65%；鼠傷寒沙門氏菌51%、53%；最大清除率可達到80%以上(見圖4中A)。

SAEW對96孔板中培養48 h后的蠟樣芽孢桿菌生物膜沒有明顯清除作用；但可一定程度上清除大腸桿菌、銅綠假單胞菌、阪崎腸桿菌、金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌的單一菌種生物膜，其清除率呈現出隨處理濃度先增大后減小的趨勢，在30 μg/mL具有最大清除率69%。

(+)-4-萜品醇與SAEW的協同作用見圖4中C和D。(+)-4-萜品醇與30 μg/mL的SAEW共同作用對單一菌種菌膜具有明顯的菌膜清除能力，其清除率約為38%～73%，低于(+)-4-萜品醇單獨作用；8 μmol/mL和16 μmol/mL的(+)-4-萜品醇在生物膜清除率上無顯著差異。(+)-4-萜品醇與SAEW協同清除蠟樣芽孢桿菌/鼠傷寒沙門氏菌混菌生物被膜的作用見圖4中D，其清除率在SAEW濃度為30 μg/mL和(+)-4-萜品醇濃度為16 μmol/mL時達到最大62%；16 μmol/mL(+)-4-萜品醇的協同清除效果略高于8 μmol/mL。

上述實驗結果顯示：(+)-4-萜品醇處理30 min對已形成的蠟樣芽孢桿菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌、阪崎腸桿菌、金黃色葡萄球菌和鼠傷寒沙門氏菌生物膜具有顯著清除作用，其清除率隨著濃度的增加而增大；而SAEW對蠟樣芽孢桿菌生物膜的清除作用不明顯，對其他5種生物膜的清除作用在30 μg/mL最強；(+)-4-萜品醇的清除效果優于SAEW。(+)-4-萜品醇與SAEW共同處理已形成的生物膜，其清除率高于SAEW單獨作用。

2.4 FESEM微觀結構觀察

PU、PVC是食品加工中常見傳送材料和典型食品接觸面。采用FESEM觀察蠟樣芽孢桿菌/鼠傷寒沙門氏菌混合生物膜在PU、PVC上的黏附情況，及(+)-4-萜品醇、SAEW處理菌膜微觀結構的變化，見圖5。

圖5 (+)-4-萜品醇與微酸性電解水對PVC和PU表面蠟樣芽孢桿菌/鼠傷寒沙門氏菌混菌生物膜微觀結構的影響Fig.5 Effects of (+)-4-terpineol and SAEW on the microstructures of the mixed biofilms of B.cereus and S.typhimurium on the surfaces of PVC (A) and PU (B)

對照組見圖5中A(i)、B(i)，24 h培養后，蠟樣芽孢桿菌和鼠傷寒沙門氏菌在PVC、PU材料上形成了致密的混菌生物膜，可觀察到胞外基質包裹的長短不一的桿狀菌體細胞；PVC材料表面的生物膜中，菌體呈交疊狀排列，生物膜表面能觀察到無規、均勻排布的空隙。

30 μg/mL SAEW對PU和PVC表面的蠟樣芽孢桿菌/鼠傷寒沙門氏菌混菌生物膜有明顯的清除效果，但可觀察到材料上殘余的生物膜表面形成了極致密的薄膜狀物質包裹住大量菌體(見圖5中A(iii)、B(iii))，這一現象可能與2.3中觀察到SAEW菌膜清除率隨濃度先增大后減小的結果(見圖4中B)有關。8 μmol/mL的(+)-4-萜品醇處理PU和PVC表面菌膜30 min后，PU和PVC表面的生物膜被大量清除，可觀察到少量稀疏的菌體聚集物黏附在表面，其清除效果優于30 μg/mL的SAEW，見圖5中A(ii)、B(ii)。

(+)-4-萜品醇(8 μmol/mL)與SAEW(30 μg/mL)的聯合清除作用見圖5中A(iv)、B(iv)。盡管(+)-4-萜品醇與SAEW聯用對蠟樣芽孢桿菌/鼠傷寒沙門氏菌混菌生物膜仍有明顯清除作用，其清除效果略優于SAEW單獨作用，但不如(+)-4-萜品醇單獨處理組。推測SAEW處理時導致了未脫落細菌胞外基質的致密化(見圖5中A(iii))，阻礙了(+)-4-萜品醇向生物膜內部的進一步滲透，細菌黏附作用增強，在一定程度上阻礙了生物膜的清除效果。

上述實驗結果顯示：8 μmol/mL的(+)-4-萜品醇與30 μg/mL的SAEW處理3 min，均能有效減少PU和PVC表面的蠟樣芽孢桿菌/鼠傷寒沙門氏菌混菌生物膜，但尚不能達到完全清除作用，在實際應用中，可考慮與高壓水形成的機械剪切力共同作用，進一步提高清除效果。(+)-4-萜品醇單獨處理組的效果優于SAEW處理組，由于SAEW處理可能導致胞外基質致密化形成滲透阻礙，二者的協同效果不明顯。

3 結論

通過對(+)-4-萜品醇對蠟樣芽孢桿菌等食源性病原菌的抑菌活性、生物膜清除能力、菌膜微觀結構及與SAEW協同作用的研究，證實(+)-4-萜品醇單體具有廣譜抑菌作用，其最低抑菌濃度為2 μmol/mL，與SAEW具有協同抑菌作用；(+)-4-萜品醇能夠快速清除蠟樣芽孢桿菌及各類細菌生物膜，清除率可達80%以上，清除效果顯著優于SAEW。(+)-4-萜品醇有望成為安全、高效的廣譜抗菌劑和細菌生物膜清除劑，應用于食品加工領域。