基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的葛根降糖機(jī)制研究

舒建中 李穎慧 蒲雨晴 劉慶靈 張 娟 甘玉立 謝永芳▲

1.重慶市中醫(yī)院腦病科，重慶 400021；2.重慶郵電大學(xué)生物信息學(xué)院，重慶 400065

葛根為多年生草質(zhì)藤本植物[1]，內(nèi)含有葛根素、大豆黃酮苷等豐富的黃酮類化合物，還有蛋白質(zhì)氨基酸、糖和人體必需的鐵、鈣、銅、硒等礦物質(zhì)，藥用價值極高[2]。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，期望從成分-靶點(diǎn)-通路進(jìn)行整體預(yù)測，并闡明葛根在體內(nèi)的作用機(jī)制，選取葛根基本成分，結(jié)合靶點(diǎn)功能以及通路對蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行聚類，探討相關(guān)顯著的作用模塊及每個模塊的關(guān)鍵基因，并期望構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)以及基因本體（gene ontology，GO）功能、京都基因和基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路分析，旨在分析其靶點(diǎn)以及信號通路，對葛根成分小分子及其作用靶點(diǎn)的結(jié)合潛力進(jìn)行探究，以明確其與靶點(diǎn)的結(jié)合潛力，為最終構(gòu)建“化合物-靶點(diǎn)-信號通路”網(wǎng)絡(luò)奠定基礎(chǔ)。本研究預(yù)期通過對葛根化學(xué)成分的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析尋找葛根發(fā)揮作用的關(guān)鍵成分、靶點(diǎn)及作用通路，探討其多靶點(diǎn)多通路協(xié)同作用機(jī)制，期望能為葛根的開發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 方法

1.1 化合物成分及靶點(diǎn)分析

中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（pharmacology database and analysis platform of traditional Chinese medicine system，TCMSP）數(shù)據(jù)庫收集中草藥的組分和分子結(jié)構(gòu)、關(guān)鍵ADME（吸收、分布、代謝和排泄）參數(shù)、成分作用靶點(diǎn)等關(guān)鍵信息[3]。通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫，查詢葛根主要成分，并篩選出口服生物利用度（oral bioavailability，OB）＞30、類藥性（drug-likeness，DL）＞0.18 的小分子，研究其作用方式。獲得小分子的Chem ID，在Pubchem 數(shù)據(jù)庫中找到其對應(yīng)smile 序列，若無對應(yīng)靶點(diǎn)信息的成分，利用MOE 軟件，使用swiss target prediction 網(wǎng)站獲得其成分靶點(diǎn)信息[4]。

1.2 構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)及化合物-靶點(diǎn)-信號通路網(wǎng)絡(luò)

使用STRING 在線軟件進(jìn)行PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析，以預(yù)測靶點(diǎn)之間的相互作用，并通過metascape獲得靶點(diǎn)的相關(guān)富集通路和功能注釋，并對靶點(diǎn)進(jìn)行聚類并篩選關(guān)鍵靶點(diǎn)，通過cytoscape 對所得信息進(jìn)行整理構(gòu)建化合物-靶點(diǎn)-信號通路網(wǎng)絡(luò)。

1.3 關(guān)鍵靶點(diǎn)及分子對接驗(yàn)證

對獲得的關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證，利用MOE 軟件進(jìn)行分子對接，通過其結(jié)合能力從空間結(jié)構(gòu)匹配和能量匹配來驗(yàn)證其結(jié)合機(jī)制。觀察pose 數(shù)量、pose 之間的最佳得分以及偏離原配體程度（root-mean-square deviation，RMSD）值[3-4]。

根據(jù)經(jīng)驗(yàn)使用PDB（protein data bank）數(shù)據(jù)庫搜索含有小分子配體，且配體結(jié)構(gòu)更接近對接藥物的小分子結(jié)構(gòu)，選擇口袋和共晶配體完整的結(jié)構(gòu)和分辨率高的晶體結(jié)構(gòu)[5-6]。

2 結(jié)果

2.1 化合物成分及靶點(diǎn)分析結(jié)果

通過對葛根化學(xué)成分的篩選，共獲得4 種滿足OB＞30、DL＞0.18 的小分子，它們可能是潛在的活性成分。本實(shí)驗(yàn)分析材料為除葛根素的四種符合篩選條件的葛根主要成分：芒柄花黃素（formononetin）、谷甾醇（β-sitosterol）、3′-甲氧基大豆苷元（3′-methoxydaidzein）、大豆苷元-4′,7-二葡萄糖苷（daidzein-4′,7-digluco side）、葛根素（puerarin）。最終獲得106 個相關(guān)靶點(diǎn)的基因信息（gene symbol）來進(jìn)行后續(xù)分析。葛根成分的部分靶點(diǎn)信息見表1。

表1 葛根成分的部分靶點(diǎn)信息

2.2 構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)

從STRING 網(wǎng)站上傳葛根相關(guān)靶點(diǎn)構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)關(guān)系數(shù)據(jù)，獲得相關(guān)GO 分子功能118 條及細(xì)胞組分注釋及KEGG 通路注釋51 條。利用metascape 根據(jù)基因gene symbol 富集到的通路和生物學(xué)過程，來分群和構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)。挑選出富集程度較高的gene，注釋相關(guān)性，構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)。圖1A（封三）表示富集到的基因關(guān)聯(lián)性網(wǎng)絡(luò)；圖1B（封三）為基因富集程度網(wǎng)絡(luò)；圖2A（封三）顯示PPI 網(wǎng)絡(luò)，可以觀察到不同基因的作用關(guān)系；圖2B（封三）顯示其中主要的幾個模塊及其基因數(shù)量。

圖1 metascape 富集結(jié)果

圖2 PPI 網(wǎng)絡(luò)

2.3 構(gòu)建“化合物-靶點(diǎn)-信號通路-功能”網(wǎng)絡(luò)

將“2.2”項(xiàng)中的PPI 數(shù)據(jù)與通路和生物學(xué)過程富集數(shù)據(jù)相結(jié)合，可得三類基因模塊及代表基因（表2）；其中模塊1 包括CYP17A1、HSP90AB1、CYP19A1、CYP51A1、CYP2C19、CYP1B1；模塊2 有NR3C1、PPARG、AR、TNF、NR1H3、ESR1；HTR2C、PTGER1、HTR2A 屬于模塊3。

表2 各模塊高分代表基因

圖3（封四）繪制出了所有靶點(diǎn)相關(guān)的“化合物-靶點(diǎn)-信號通路-功能”，結(jié)果顯示，網(wǎng)絡(luò)中既存在一個分子與多個靶點(diǎn)蛋白的相互作用關(guān)系，也存在不同分子作用于同一個靶蛋白的現(xiàn)象，顯示出多成分多靶點(diǎn)多通路特點(diǎn)，一定程度上也暗示葛根可能在多種疾病上均可發(fā)揮作用。

圖3 “化合物-靶點(diǎn)-信號通路-功能”關(guān)系圖

2.4 關(guān)鍵靶點(diǎn)及分子對接驗(yàn)證

選取每組打分最高的基因靶點(diǎn)CYP17A1、NR3C1、HTR2C，進(jìn)行分子對接驗(yàn)證。在PDB 數(shù)據(jù)庫中查找符合條件的PDB 結(jié)構(gòu)，即靶點(diǎn)蛋白的三維結(jié)構(gòu)，得到CYP17A1（P05093）的靶點(diǎn)蛋白，其PDB ID為5IRQ，對應(yīng)結(jié)合的藥物小分子為β-谷甾醇；NR3C1（P04150）在PDB 數(shù)據(jù)庫中查找得到的對應(yīng)靶點(diǎn)蛋白的PDB ID 為4UDD，對應(yīng)小分子為β-谷甾醇；在PDB 數(shù)據(jù)庫中查找到得到HTR2C（P28335）的對應(yīng)靶點(diǎn)蛋白的PDB ID 為6BQH，對應(yīng)小分子為芒柄花黃素和3′-甲氧基大豆黃素。運(yùn)行MOE 軟件，分別進(jìn)行分子對接，對接打分結(jié)果見表3，對接圖見圖4（封三）。其中S值表示一系列的小分子與蛋白質(zhì)的對接pose 中的得分最佳的，通常S 值越負(fù)，對接情況越好；由于PDB 結(jié)構(gòu)中下載的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中含有小配體，因此，可以通過藥物小分子與原配體的疊合能力來預(yù)測小分子與靶點(diǎn)蛋白的結(jié)合能力，而配體與小分子的疊合能力由RMSD值來衡量，其中RMSD值越小，表示該小分子與靶點(diǎn)蛋白具有良好的結(jié)合潛力。表3 結(jié)果顯示，β-谷甾醇與ID 為4UDD 的靶點(diǎn)蛋白結(jié)合能力以及與原配體的疊合能力較好。

表3 各對接情況打分表

圖4 靶點(diǎn)與藥物分子對接

3 討論

3.1 三個模塊的降糖作用分析

目前一般認(rèn)為糖尿病發(fā)病機(jī)制與胰島素分泌和/或胰島素作用缺陷有關(guān)[7-8]，有研究表明，含葛根的湯劑配合西醫(yī)常規(guī)治療對2 型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）濕熱證患者血糖有明顯改善作用[9]。模塊1 包括CYP17A1（1.141432）、HSP90AB1、CYP19A1（1.141419）、CYP51A1、CYP2C19、CYP1B1，該模塊五個基因主要富集到類固醇代謝途徑[9]。類固醇激素及其受體主要參與真核基因表達(dá)的調(diào)節(jié)，并影響靶組織中的細(xì)胞增殖和分化。其中CYP1B1，細(xì)胞色素P450 1B1。細(xì)胞色素P450 是一組血紅素硫醇單加氧酶[10]。在肝微粒體中，該酶參與還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）依賴性電子轉(zhuǎn)運(yùn)途徑[11-12]。它會氧化類固醇、脂肪酸、類維生素A 等。模塊2 包括NR3C1、PPARG、AR、TNF、NR1H3、ESR1 主要功能富集在類固醇激素反應(yīng)以及類固醇介導(dǎo)的信號通路。PPARG 是過氧化物酶體增殖物激活受體γ；結(jié)合過氧化物酶體增殖物（如降血脂藥和脂肪酸）的核受體。一旦被配體激活，核受體就會與DNA 特異的PPAR 反應(yīng)元件結(jié)合并調(diào)節(jié)其靶基因（如酰基輔酶A 氧化酶）的轉(zhuǎn)錄，控制了脂肪酸的過氧化物酶體β-氧化途徑，是脂肪細(xì)胞分化和葡萄糖穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)器[13-14]。ARF6 充當(dāng)組織特異性脂肪細(xì)胞P2（adipocyte P2，aP2）增強(qiáng)子的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑[15]。PTGER1 是前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）受體EP1 亞型，該受體的活性由激活磷脂酰肌醇鈣第二信使系統(tǒng)的G（q）蛋白介導(dǎo)，可能是腎臟功能的重要調(diào)節(jié)劑，涉及各種組織中對PGE2的平滑肌收縮反應(yīng)，分析與腸胃蠕動消化調(diào)節(jié)有關(guān)。模塊三包括HTR2C、PTGER1、HTR2A 主要功能富集在鈣信號通路以及磷脂酰肌醇生物合成過程。

3.2 相關(guān)基因與降糖途徑分析

CYP17A1 是細(xì)胞色素P450 家族17 亞家族A 成員，可催化17-α-羥基化和17,20-裂合酶反應(yīng)，對于雄激素和糖皮質(zhì)激素的產(chǎn)生都是必不可少的。有實(shí)驗(yàn)證明，肝臟CYP17A1 在糖異生中的作用是通過其下游產(chǎn)物17-OHP 激活糖皮質(zhì)激素受體轉(zhuǎn)錄活性，使糖異生的關(guān)鍵酶基因的轉(zhuǎn)錄上調(diào)，從而促進(jìn)了糖異生的過程[16-17]。皮質(zhì)醇是主要的內(nèi)源性糖皮質(zhì)激素，它影響多種生理功能，例如脂質(zhì)和葡萄糖代謝，代謝穩(wěn)態(tài)和對壓力的適應(yīng)性。皮質(zhì)醇的生產(chǎn)主要受促性腺激素中促腎上腺皮質(zhì)激素（adrenocorticotrophic hormone，ACTH）的調(diào)節(jié)。ACTH 對皮質(zhì)醇合成的刺激作用取決于cAMP 依賴性信號傳導(dǎo)，但也涉及膜去極化和胞漿Ca2+增加。cAMP 和Ca2+各自誘導(dǎo)StAR 的表達(dá)，刺激線粒體內(nèi)膽固醇的轉(zhuǎn)移，以及從膽固醇到皮質(zhì)醇的途徑中的類固醇生成酶（例如CHE、CYP17A1、CYP11B1）[16]。

NR3C1 是糖皮質(zhì)激素受體，具有轉(zhuǎn)錄抑制活性。NR3C1 是應(yīng)激反應(yīng)系統(tǒng)的關(guān)鍵組成部分。糖皮質(zhì)激素對糖代謝具有干擾作用，與胰島素的降糖有拮抗作用，是胰島素反調(diào)節(jié)激素，糖皮質(zhì)激素過多可能會導(dǎo)致繼發(fā)性糖尿病[17-18]。有研究表明，糖皮質(zhì)激素可以應(yīng)用到某種糖尿病患者的臨床治療中，可以有效控制炎癥反應(yīng)、減少血糖波動[19-20]。

HTR2C 是G 蛋白偶聯(lián)的5-羥色胺受體，有研究表明，基因HTR2C 與高血糖、神經(jīng)系統(tǒng)疾病以及免疫代謝等方面有關(guān)[21]。

綜上所述，通過構(gòu)建葛根多成分-靶點(diǎn)-信號通路，并對靶點(diǎn)基因功能和代謝通路進(jìn)行分析，借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的思路解釋葛根降血糖的可能作用機(jī)制。文中預(yù)測的靶點(diǎn)與已知的藥理作用相吻合，說明靶點(diǎn)預(yù)測的準(zhǔn)確性，獲得其主要靶點(diǎn)有三個，分別為CYP17A1、NR3C1 和HTR2C，揭示了葛根作用的多成分、多靶點(diǎn)、整合調(diào)節(jié)作用特點(diǎn)。