食品微生物檢驗中ATP發光法的應用

曾翠平 龐素蘭

408200重慶市豐都縣疾病預防控制中心

食品微生物檢驗中ATP發光法的應用

曾翠平 龐素蘭

408200重慶市豐都縣疾病預防控制中心

近些年來食品安全問題突出，已經成為社會焦點問題之一。因此，需加強食品檢測工作，保證食品安全。隨著生物技術的不斷發展，食品檢驗技術日益進步，ATP生物發光檢測法因其靈敏度較高且操作便捷，已被廣泛應用。本文首先對生物檢驗技術在食品檢測中應用的重要性進行分析，其次對ATP發光法的作用原理進行闡述，然后就食品微生物檢驗中ATP發光法的具體應用進行總結。

ATP發光法；微生物檢驗；食品安全

食品衛生關乎人們的身體健康與生命安全，是人們普遍關注的一個社會問題。隨著人們對食品衛生質量要求的不斷提高，食品衛生檢驗技術也在不斷地完善和進步。微生物檢驗是確保食品安全衛生的一個重要環節，是對食品質量的重要保障。但是，在食品微生物檢驗的過程中，影響檢驗質量的因素是多方面的，如果不能很好地對這些影響因素進行有效控制，檢驗結果就可能有很大的偏差，使得食品衛生無法得到保證。因此，對食品微生物檢驗的質量控制進行全面的探究是非常重要的。

食品檢驗中現代生物技術應用的重要性

一個較高品質的食品安全方面的檢驗能夠在一定程度上保證食品的安全性。最近這些年我們國家對于食品安全的問題越來越重視，借助了現代生物理論作為基礎，現代生物技術能夠應用到的領域也變得越來越廣泛了。除此以外，生物技術在近些年越來越有優勢，有更加安全并且環保、能夠精準地進行測試和檢驗等特點，在食品的安全檢驗當中運用得十分順手。要保證食品的安全性，傳統的生物以及食品的檢驗技術是不具有相關的優勢的，現代生物技術具有良好的發展前景。為此，本文以ATP技術為例對其檢測方法進行深入探究。

ATP生物發光法分析

ATP生物發光法是一種較為高效且操作便捷的檢測方法，只需幾分鐘便可得到檢測結果[1]。技術原理為將細菌內的ATP從自由可溶解的狀態中釋放出來，在有熒光素酶、鎂、氧氣存在的條件下和蟲熒光素發生反應產生熒光，通過對熒光信號的判斷對ATP的含量進行推測和計算，以檢測樣品中的含菌量。其反應過程如圖1所示。以往ATP生物發光僅用于細菌、酵母以及其他真菌的檢測工作中。但其缺陷是靈敏度不高，對于細菌數量也有嚴格限制，一般在103～104CFU/mL。相關技術人員以及學者研究開發了ATP再生系統，提高了此方法的靈敏度，從而有效彌補了傳統ATP發光法的缺陷。所謂ATP再生系統就是指利用生物發光主反應產生的焦磷酸以及AMP作試劑[2]，并添加相應的底物以及酶系，促進PPI或者是AMP產生ATP，使得反應體系的熒光信號更強，檢測結果更加直觀。但是該測驗體系也存在不足之處，如反應體系中的酶較多，酶促反應會相互影響，對測驗結果造成影響，重復性較差。

圖1 ATP再生途徑

食品微生物檢驗中ATP發光法的應用(以酸奶Fe3O4檢測為例)

試驗方法：①化學發光檢測：將氨基改性的Fe3O4納米粒子1.0 μmol取出，使用吡啶緩沖液，并添加適量的戊二醛溶液，通常添加量200 μL，放置于室溫環境下，對其進行持續振蕩3 h。對其進行反復清洗，然后將10 pmol ATP適體加入，持續振蕩1 h，同樣放置于室溫環境下，隨后進行反復清洗。采用的是WB清洗液，將200 μL 2%的BSA溶液加入其中，持續振蕩，時間1 h，溫度同樣為室溫。采用WB清洗液對其進行的反復清洗，再將Fe3O4納米粒子置于ATP(濃度 2、4、6、8、10、12 μmol/L)溶液100 μL中，室溫下進行持續1 h的振蕩。使用WB清洗液反復清洗，進行磁性分離，然后使用超純水將Fe3O4納米粒子轉移至圓柱形玻璃瓶中，此圓柱形玻璃瓶一端開口，將其放在BPCL微弱發光儀中，添加熒光素酶緩沖液90 μL，測量熒光發光強度，將出現最高信號值后的10 s的積分值作為最終信號值。②對ATP的特異性利用化學發光法進行檢測及進行干擾性實驗：取出氨基改性的Fe3O4納米粒子1.0 μmol，反復清洗，采用的是吡啶緩沖液，并將適量的戊二醛溶液添加其中。通常添加量200 μL，持續振蕩3 h，然后加入ATP適體10 pmol，持續振蕩1 h。隨后進行反復清洗，采用WB清洗液，添加2%的BSA溶液200 μL，持續振蕩1 h。上述持續振蕩的溫度環境均是室溫，使用WB清洗液反復清洗，將10 μmol/L的ATP溶液加入CTP溶液、UTP溶液、空白AA緩沖液、ATP和GTP混合液、ATP和CTP混合液、GTP溶液之中，ATP、GTP、CTP和UTP混合液、ATP和UTP混合液，濃度均100 μL，持續振蕩1 h，同樣是室溫環境。反復洗滌，使用的是WB清洗液，磁性分離。然后使用超純水10 μL將Fe3O4納米粒子轉移至一端開口的圓柱形玻璃瓶，將其放在BPCL微弱發光儀中待測，添加熒光素酶緩沖液90 μL，測量樣品的熒光強度[3]。

結果：根據檢測結果繪制了曲線圖。由圖可知，當R2=0.996 3時，其范圍內的線性良好，適用于ATP的定量檢測。化學發光法檢測ATP干擾性的試驗結果：當溶液為CTP、GTP、UTP時，熒光強度較低；當溶液為ATP、CTP、GTP、UTP的混合物時，不會對熒光強度造成較大影響，實驗的可行性較高。對酸奶中的ATP進行檢測，提取出乳酸菌中ATP，再對Fe3O4納米粒子進行實驗，特異性捕獲ATP，化學發光法檢測其發光值。試驗結果顯示當乳酸菌的含量越大時，提取的ATP量越大，化學發光值也會提升，實驗的重復性較為突出。依據圖2繪制的ATP工作曲線進行計算可知每mL酸奶的乳酸菌中所含ATP的量為3.98×10-8mol，由此可見本次試驗制備的Fe3O4納米粒子可作為載體應用于分析食品檢測領域，見圖2、圖3。

綜上所述，ATP發光法仍然存在不足，將其應用于食品檢測工作時需要科學地制定試驗流程，合理配置試驗試劑，才能保證試驗的可行性和有效性。同時，需加強技術研究，完善該檢測技術，提高靈敏度，增強其對抗干擾能力。

圖2 化學發光檢測ATP工作曲線

圖3 不同溶液中ATP發光值的測定

[1]王福厚,張士珍,李娟.ATP生物發光技術在微生物快速檢測中的應用[J].國外畜牧學-豬與禽,2015,35(5)：89-90.

[2]劉翔軍.食品微生物檢測新技術及發展趨勢[J].廣東化工,2013,40(1)：75-76.

[3]李海月,黃繼紅,張新武,等.ATP生物發光法快速檢測食源性致病菌的研究[J].河南工業大學學報(自然科學版),2016,37(1)：67-71.

Application of ATP bioluminescence method in microbiological examination of foods

Zeng Cuiping,Pang Sulan
Center for Disease Control and Prevention of Fengdu County,Chongqing City 408200

In recent years,food safety issues have become prominent,and has become one of the social problems.Therefore,it is necessary to strengthen food testing work to ensure food safety.With the development of biotechnology and the progress of food inspection technology,ATP bioluminescence detection method has been widely used because of its high sensitivity and convenient operation.In this paper,the importance of biological detection technology in food testing was analyzed firstly,secondly,the principle of ATP luminescence method is expounded,and then the specific application of ATP luminescence method in food microbiological examination is summarized.

ATP chemiluminescence method;Microbiological examination;Food safety

10.3969/j.issn.1007-614x.2017.24.90