蛋白質-多酚復合物的形成機制及其功能性變化研究進展

趙鉅陽，袁惠萍，孫昕萌

（哈爾濱商業大學旅游烹飪學院，黑龍江哈爾濱 150030）

多酚類物質是廣泛存在于食物中的一類重要的植物化學物質[1]，目前相關研究已表明這些多酚類物質在多種疾病中具有較強的抗氧化[2]以及抑菌[3]、抗衰老[4]等功效。在食品體系中，多酚可與蛋白質通過可逆和不可逆的方式發生相互作用形成復合物，進而影響蛋白質結構、功能和生物利用度等[5-6]。相互作用方式影響蛋白質與多酚結合程度，另外，不同的反應條件下多酚與蛋白的結合程度也受到一定的影響，因此由于蛋白質與多酚種類、二者反應條件不同，均會影響多酚與蛋白質的結合位點、結合程度，二者形成的復合物結構也不同，進而導致復合物的功能性以及營養學等方面性質發生改變[7-8]。蛋白質的結構影響功能性（溶解性、乳化性、凝膠性等），利用其功能性可拓寬蛋白質的應用范圍，因此為更好地了解蛋白質與多酚的相互作用，拓寬其應用，學者需借助研究方法更為清晰的了解互作機理，研究二者之間功能性等變化。

近些年來，已有較多學者研究蛋白質與多酚相互作用機制[9]，已經明確二者之間的相互作用方式，但未能形象地總結二者的研究方法[10]，研究蛋白質-多酚復合物的功能及營養學特性等方面的綜述也不系統。基于此，本文綜述了近年來有關于蛋白質-多酚復合物形成機制，介紹了可逆和不可逆的兩種相互作用方式，及其對蛋白質結構特性、食品感官及營養學特性等方面影響的研究進展，以期為未來蛋白質-多酚復合物的發展提供參考意見。

1 蛋白質-多酚復合物的形成機制

蛋白質-多酚復合物的作用類型主要是可逆和不可逆相互作用作用[11]，其中可逆相互作用主要指非共價相互作用，其復合物主要以自組裝的形式形成，目前此方面國內外學者研究較多；不可逆相互作用主要指共價相互作用，其復合物主要在加熱、堿性或酶催化條件下形成，針對此方面研究相對較少[12]。

1.1 可逆相互作用

可逆相互作用指的是非共價相互作用，包括氫鍵、疏水相互作用、范德華力和離子相互作用[13]。目前研究主要集中在可逆相互作用，這主要是由于缺乏合適的方法來測定復合物的結構。一般來說，蛋白質-多酚復合物的形成主要依賴于氫鍵（圖1a）和疏水相互作用（圖1b），其次是其他相互作用（如離子鍵）（圖1c）。針對可逆相互作用方面學者已經進行了關于多酚與唾液蛋白、牛血清白蛋白、β-乳球蛋白、卵清蛋白、溶菌酶、乳鐵蛋白和酪蛋白等方面的研究[14]。

圖1 蛋白質和多酚的非共價相互作用位點[15]Fig.1 Non-covalent interaction sites of protein and polyphenol[15]

1.2 不可逆相互作用

不可逆相互作用指的是共價相互作用[16]，共價相互作用制造蛋白質-多酚復合物的常用方法的原理如圖2 所示。堿性反應是多酚和蛋白質結合常用的非酶方法之一，多酚在堿性（pH9.0）及有氧的條件下被氧化形成半醌，然后再重排成醌。這些中間產物易與蛋白質側鏈中的親核殘基（蛋氨酸、賴氨酸、色氨酸和半胱氨酸）反應，可以形成蛋白質和多酚之間的共價交聯（C–N 或C–S）[17]（圖2a）。Gu 等[18]發現自由基誘導產生的共軛物比堿性方法形成的共軛物具有更高的抗氧化活性。此外，反應可在室溫下進行，不會產生有毒產物或分解抗氧化劑[19]。因此，該方法被認為是制備具有生物活性高的蛋白質-多酚復合物的有效合成方法。

酶法是一種環境友好、特異性高的方法，其合成的復合物具有較強的自由基清除活性。然而，所用的制備和程序復雜且昂貴[18]。首先酚酶誘導多酚氧化成鄰二酚，隨后，在氧氣條件下，鄰二酚酶（漆酶）將鄰二酚轉化為鄰醌[17]（圖2b），活性醌可與蛋白質鏈中的親核氨基酸殘基相互作用形成交聯蛋白質或聚合物。

圖2 蛋白質和多酚的共價相互作用機理[15]Fig.2 Covalent interaction mechanism of protein and polyphenol[15]

對于非酶法，采用自由基接枝（圖2c）、抗壞血酸和過氧化氫，非酶法簡單快捷，應用廣泛。首先，位于蛋白質側鏈上的氨基酸被自由基氧化，然后自由基通過共價鍵與多酚反應，形成較強的相互作用以及高穩定性的蛋白質-多酚復合物。

2 蛋白質-多酚復合物對蛋白質結構及功能性的影響

2.1 蛋白質-多酚復合物對蛋白質結構的影響

多酚的加入會對蛋白質的結構產生影響，從而引起蛋白質功能性發生變化[20-22]。蛋白質的一級、二級、三級結構會由于多酚而發生變化，其中二級結構中的α-螺旋的含量減少，向無規則卷曲轉變，蛋白質較不穩定。Li 等[23]研究水稻蛋白與花青素的相互作用，SDS-PAGE 結果表明，花青素不會影響蛋白質的一級結構，但水稻蛋白二級結構發生改變β-折疊含量的增加和其它結構（α-螺旋、β-轉角和無規則卷曲）的減少以及酰胺Ⅱ帶的光譜位移。皮俊翔等[24]研究茶多酚對面筋中的面筋蛋白的影響，研究結果表明茶多酚使面筋蛋白游離氨基和自由巰基的含量增加，蛋白二級結構向無序化轉化，并同時使蛋白質中色氨酸殘基逐漸暴露。Chen 等[25]研究發現pH 可使乳清分離蛋白中游離巰基含量降低和二硫鍵含量增加，α-螺旋和β-折疊含量減少，而β-轉角和無規則卷曲含量增加。Chen 等[26]研究發現預熱處理的花青素-3-O-葡萄糖苷的結合使大豆分離蛋白（SPI）的二級結構發生變化，α-螺旋和無規卷曲結構減少，β-折疊和β-轉角增加，能顯著提高花青素-3-O-葡萄糖苷的熱穩定性和氧化穩定性。Jiang 等[27]花青素與SPI 共價結合后，α-螺旋和β-折疊的含量減少，從而改變了SPI 的二級結構，且由于多肽鏈的展開，SPI 的三級結構也受到了影響。

2.2 蛋白質-多酚復合物對蛋白質功能性的影響

蛋白質和多酚之間的相互作用影響蛋白質的二級和三級結構[28]，進而改變蛋白質的表面疏水性，從而增強蛋白質的親水性。蛋白質親水/疏水平衡的變化可能會影響蛋白質-多酚復合物的溶解性，進而影響其他重要功能特性。目前對于蛋白質-多酚復合物對蛋白質的功能性質造成影響的研究主要集中在蛋白質的起泡性、溶解性、凝膠性、乳化性等。影響蛋白質與多酚相互作用的主要因素有兩個，包括外在（pH 和溫度[29]）和內在（多酚和蛋白質的結構和類型[30]）因素。

2.2.1 溶解性 蛋白質溶解度是確定蛋白質在不同食品體系中的各種功能的一個重要性質[31]，蛋白質與多酚的結合對蛋白的溶解性具有兩面性。一方面研究表明多酚的加入會提高蛋白質的溶解性，例如，乳清分離蛋白和酪蛋白與綠原酸非共價作用后，蛋白質溶解度可增加[32]。Hasni 等[33]研究茶多酚與酪蛋白之間的相互影響，結果表明茶多酚與蛋白質之間的相互作用力是氫鍵、疏水鍵，二者發生交聯作用，改變蛋白質的電荷，提高溶解性。另一方面，多酚的加入會降低蛋白質的溶解性。Prigent 等[32]研究發現添加原花青素后，在pH4.0～6.0 范圍內，蛋白質溶解度降低，其原因是帶電荷的多酚類物質的附著可能會改變蛋白質的電性，特別是當pH 在蛋白質等電點附近時，可能會改變蛋白質的溶解度曲線。除此之外，若結合的多酚為非極性時，則會導致蛋白質表面疏水性增加，致使其溶解性降低。非極性多酚類物質的結合增加了蛋白質的表面疏水性，這不僅可以增加其表面活性，還可以降低其溶解性。多酚和蛋白質之間的反應可能促進蛋白質的交聯，這也可能降低其溶解性。但是二者復合后會促使多酚的溶解性提高，因此可以通過蛋白質-多酚復合作為多酚輸送載體。Chen 等[34]研究姜黃素與未加熱和加熱（75～95 ℃）大豆蛋白的絡合，與在水中的游離姜黃素相比，姜黃素的溶解性在水中的絡合度超過98000 倍。

2.2.2 乳化性 為了穩定食品乳狀液，通常在食品體系中加入乳化劑以保證乳狀液的穩定性[35]。蛋白質與多酚的復合是修飾蛋白質功能的有效途徑，合成具有優良乳化性能的蛋白質-多酚復合物。目前已有大量研究表明多酚的加入可提高蛋白質的乳化性和乳化穩定性。江連洲等[36]研究熱處理的SPI 與花青素相互作用機制，發現花青素的加入可提高SPI 乳化性、乳液穩定性等性能。Anwika 等[37]研究SPI-茶多酚復合物顯著提高SPI 的乳化能力，可達43%，乳化穩定性可達59%。以綠茶多酚提取物添加量0.75%制備的SPI-茶多酚復合物具有較好的乳化性能。不同的多酚類型對蛋白質-多酚復合物乳化性也有差異，Liu 等[38]采用自由基接枝法合成了乳鐵蛋白-多酚（EGCG、綠原酸和沒食子酸）復合物，其乳化性能優于未改性的乳鐵蛋白，與乳鐵蛋白-EGCG 復合物和乳鐵蛋白-沒食子酸復合物相比，乳鐵蛋白綠原酸復合物顯示出更高的乳化性能。

2.2.3 凝膠性 多酚能與蛋白質相互作用形成蛋白質-多酚復合物，產生具有改進性質的凝膠。一般來說，蛋白質的氧化不可避免地發生在肉制品中，與加工過程中天然肉肌肉的破壞有關[39]。當多酚類物質被加入肉制品，蛋白質被氧化，隨后產生醌。因此，氨基酸基團和醌的反應導致凝膠性能增強，從而形成彈性凝膠網絡。蛋白質-多酚復合物的凝膠與添加多酚的量具有一定的影響。Cao 等[40]研究了不同濃度的沒食子酸對氧化肌原纖維蛋白質凝膠特性的影響，當沒食子酸濃度分別為6 和30 μmol/g 時，肌原纖維蛋白質的膠凝勢提高了近50%，這與蛋白質的展開及二硫鍵的形成有關。然而，當沒食子酸濃度為150 μmol/g 時，會誘導肌原纖維蛋白質的聚集，形成不溶性聚合物，導致凝膠結構變差。李立敏等[41]研究表明，添加適量的茶多酚能顯著改善羊肉肌原纖維蛋白的凝膠性能，凝膠的微觀結構致密、間隙小、形狀規則、分布均勻。

2.2.4 其他性質 多酚會影響蛋白質-多酚復合物的起泡性等性質。Sui 等[42]研究不同濃度的花青素對蛋白質結構的影響，結果表明花青素提高了大豆分離蛋白的乳化和發泡性能。岳鑫[43]研究發現紅松種鱗多酚提高了乳清蛋白的起泡性，當紅松種鱗多酚添加量為0.8%時，乳清蛋白的起泡性達到最佳，并且紅松種鱗多酚增強了乳清蛋白的持油性和持水性。此外，蛋白質-多酚復合物的形成可提高蛋白的抗氧化能力，如Xiang 等[44]研究發現與游離態的姜黃素相比，在1%和8%的蛋白質含量下，SPI、經谷氨酰胺酶處理的大豆蛋白及其與姜黃素的復合物均表現出顯著的DPPH 自由基清除活性，這可能是由于游離形式的姜黃素在水中溶解度和穩定性較差。蛋白質-多酚復合物的形成有助于進一步提高多酚的抗腫瘤能力，如陳飛平[45]研究發現大豆蛋白-姜黃素復合物可提高姜黃素對HepG2 細胞的增殖抑制活性。

3 蛋白質-多酚復合物對營養學特性及食品感官特性的影響

3.1 蛋白質-多酚復合物對蛋白和多酚營養學特性影響

蛋白質的營養學特性主要包含其人體胃腸道消化性的變化和營養價值評估。其中食源蛋白質的營養價值取決于其蛋白質來源、氨基酸組成、必需氨基酸的比例、加工條件等因素[46]。目前已有相關研究表明蛋白質-多酚復合物的形成影響蛋白質的消化特性及營養學特性[47]，例如多酚-蛋白質共價復合物的形成會改變蛋白質的氨基酸分布，蛋白質與水解酶的相互作用會干擾蛋白質在體內的消化與吸收。牛奶蛋白質與咖啡酸在加熱過程中發生相互作用，形成復合物，導致牛奶營養價值降低，表現為可用賴氨酸和硫醇基團的數量減少，這與咖啡酸氧化導致醌產生以及隨后與氨基酸形成絡合物有關[48]。高粱中主要高粱蛋白（高粱醇溶蛋白）與單寧發生相互作用，形成復合物，導致高粱蛋白質消化率降低[49]。

另一方面，蛋白質-多酚復合物不僅可影響蛋白的營養學特性，也會顯著影響多酚的營養學特性，這主要表現為多酚生物利用度的提高。Kadam 等[50]模擬體外模擬胃腸消化，結果表明復合后姜黃素的生物利用率由67%提高到95%。Francisco 等[51]研究發現槲皮素負載的玉米醇溶蛋白納米顆粒在胃腸消化過程中較為穩定，提高了槲皮素的生物利用度。Jing 等[52]研究茶多酚-蛋清蛋白復合物對蛋清蛋白消化率的影響，發現茶多酚-蛋清蛋白復合物顯著提高了消化率，其原因可能是復合物松散表面結構為消化酶提供了更多的反應位點。Liu 等[53]研究發現，與游離的白藜蘆醇相比，α-乳清蛋白、殼聚糖和白藜蘆醇三者間復合物的生物可利用度明顯提高50%以上。

3.2 蛋白質-多酚復合物對食品感官的影響

多酚與蛋白質的共價作用會引起食品體系混濁、顏色、風味等的變化，多酚和蛋白質的共價作用會使體系的濁度降低。蛋白質-多酚復合物可引起食品體系渾濁，例如油菜籽蛋白產品的顏色變暗和不良風味的出現與其中多酚和蛋白質的作用也有密切的關系。

蛋白質-多酚復合物可影響食品體系的顏色，其顏色主要依賴于多酚以及蛋白質與多酚相互作用。曾亮等[54]研究發現，兒茶素在貯藏期間能顯著改變鴨胸肉的白度、紅度和黃度，對肉的白度和黃度有較好的影響，對肉的紅度有負面影響。劉芝君等[55]研究發現，添加茶多酚能抑制脂肪氧化變質，能使臘肉保持較好的顏色。

蛋白質-多酚復合物可影響食品體系的風味。生活中比較常見的澀味和植物多酚的存在有著密不可分的關系[56]。澀味是與食用富含酚類化合物的食品和飲料（例如茶、可可、葡萄酒和精選水果）有關的風味之一[57]。酚類化合物和唾液淀粉酶之間的相互作用導致澀味，用蛋白對葡萄酒進行細化以減輕其澀味是一種常見的釀酒工藝。葡萄酒的顏色變化與形成更穩定的色素（例如吡喃花色素、白藜蘆醇四聚體和葡萄花青素的衍生物）有關。微氧化處理包括紅酒與氧氣的接觸，穩定顏色并改善風味和香味，影響酚類化合物結構，從而改變澀味[58]。除了澀味外，還可影響食品體系的其他風味。梁慧等[59]研究了茶多酚對雞氧化性脂肪誘導的蛋白質變性的影響，結果表明，茶多酚能抑制雞肉氧化脂肪的降解，延長雞肉的貨架期。

4 蛋白質-多酚復合物形成機制的常見研究方法

多酚和蛋白質的結合方法可通過計算結合常數來確定力的類型，分析結合前后蛋白質構象變化。除紫外可見吸收光譜、熒光光譜、傅立葉紅外光譜等常規方法外，分子對接、圓二色譜、拉曼光譜、核磁共振、等溫滴定量熱法等新方法逐漸被用來分析多酚與蛋白質的相互作用機理。

4.1 分子對接

分子對接是利用計算機軟件進行處理的技術，通過分子對接可以得到多酚與蛋白質相互作用的最佳結合自由能、結合位點和作用力類型，對結合位置和結合親和力能更準確的預測，可大大減少昂貴的實驗工作[60]。胡淼等[61]通過分子對接的方法模擬了矢車菊素-3-葡萄糖苷分別與11S 蛋白、7S 蛋白的最優結合構象，它們之間存在較強疏水作用力的同時，部分結構之間也形成了氫鍵，有助于復合體系的形成（圖3）。范金波等[62]利用熒光光譜法結合分子對接探究咖啡酸與牛血清白蛋白相互作用機制，分子對接結果表明兩者結合的主要驅動力為氫鍵、靜電相互作用和疏水相互作用，結合位點為位點I。Fu 等[63]采用分子對接研究了酸性和中性pH 環境下花青素-3-O-葡萄糖苷與卵清蛋白的相互作用，結果表明，二者間的作用力主要是氫鍵和范德華力。

圖3 11S 蛋白（a）、7S 蛋白（b）與矢車菊素-3-葡萄糖苷的對接結構結構圖[61]Fig.3 docking structure of 11S protein（a）and 7S protein（b）with cyanidin-3-glucoside[61]

4.2 圓二色譜

蛋白質的遠紫外圓二色譜反映了蛋白質二級結構的特征，可用來分析α-螺旋、β-轉角等構象含量，因此通過圓二色譜可分析蛋白質-多酚復合物近紫外圓二光譜（>250 nm）酪氨酸和色氨酸等殘基微環境，進而判斷蛋白的三級結構的變化[64]。多酚與蛋白質復合后，最常見的表現是其α-螺旋含量減少，無規則卷曲結構的增加，這說明多酚的加入會促使蛋白結構展開，向不穩定、不規則的結構轉變。朱穎等[65]利用圓二色譜研究發現了大豆蛋白和花青素非共價相互作用后，其α-螺旋相對含量減少，β-折疊相對含量上升的現象。Chen 等[66]利用圓二色譜研究表明，pH 顯著增加了負峰的強度，并引起了峰波長的藍移，β-折疊和α-螺旋向β-轉角和無規則卷曲轉變。徐潔瓊[67]利用圓二色譜研究熱處理下β-乳球蛋白及與茶多酚復合物的二級結構含量，發現β-轉角和α-螺旋向β-折疊和無規則卷曲轉變。

4.3 拉曼光譜

拉曼光譜可以得到蛋白質側鏈的微環境以及多肽鏈骨架構型的信息[68]。雖然拉曼光譜結果反映的是蛋白質二、三級結構的變化，但是多酚與蛋白質復合后，其拉曼光譜結果較為復雜，并未有較為統一的規律，這可能是由于不同來源的蛋白質與多酚微環境復雜，會影響光譜信噪比。例如Bhattacharya 等[69]利用拉曼光譜研究發現，EGCG 結合后蛋白質的螺旋含量隨著無序結構的增加而減少。然而謝鳳英等[70]得到的拉曼光譜結果正相反，其研究蕎麥多酚與米糠蛋白復合后可通過破壞二硫鍵提高米糠蛋白的穩定性。此外，由于拉曼光譜主要集中于蛋白質的二級結構，因此若體系里多酚含量較大時，其特征峰幾乎未見。如Liu 等[71]對利用拉曼光譜分析負載白黎蘆醇和姜黃素的納米顆粒，并未觀察到多酚官能團特征峰。

4.4 熒光光譜

熒光光譜可通過內源性熒光光譜圖中熒光強度的變化分析蛋白質-多酚復合物酪氨酸和色氨酸等殘基微環境，還可通過Stern-Volmer 方程分析獲得酚類化合物與蛋白質親和性的結合常數、結合位點和結合力類型，進而探究多酚-蛋白的結合機制。此外，同步熒光光譜通過設置改變激發波長分別獲得色氨酸和酪氨酸的微環境變化；三維熒光光譜既可通過峰a 獲得酪氨酸和色氨酸殘基的微環境，又可通過峰b 獲得蛋白質多肽鏈的骨架結構變化。Li 等[72]利用內源性熒光光譜研究發現疏水鍵和氫鍵是水稻蛋白-花青素復合物形成的主導力，并且二者之間是靜態淬滅。江連洲等[36]通過內源性和三維熒光光譜研究發現花青素與熱處理的SPI 的熒光淬滅機制為靜態淬滅，色氨酸和酪氨酸的微環境發生改變。操強等[73]利用內源性、同步和三維熒光光譜研究發現白藜蘆醇使卵白蛋白氨基酸微環境發生變化，進而導致蛋白質三級結構發生改變，其淬滅為動態淬滅，作用力為氫鍵和范德華力。

4.5 核磁共振

核磁共振主要用于確定分子的結構，可監測到蛋白質信號的化學位移變化，目前核磁共振和分子模型的結合也被成功地用于在分子水平上理解蛋白質與多酚復合物結合過程。Silva 等[74]利用核磁共振技術研究唾液蛋白與食物單寧的分子相互作用，結果發現單寧-蛋白質的主要驅動力是疏水鍵。Eaton等[75]利用核磁共振測定了EGCG 對人血清白蛋白的親和力，結果表明幾乎所有的EGCG 都是在血液中與白蛋白結合運輸的，這也解釋了EGCG 在體內的廣泛組織分布和化學穩定性。Faurie 等[76]利用核磁共振測定唾液肽、多酚和多糖之間的解離常數和結合位點數，得到化學位移的變化、核磁共振波峰面積的變化和形成復合物的大小。

4.6 等溫滴定量熱法

等溫滴定量熱法研究多酚-蛋白質相互作用的主要優點是可獲得每個樣品產生的有關焓、熵、親和力、比熱容和化學計量的信息，進而通過多酚-蛋白質結合常數、相互作用類型等洞悉二者復合機制[77]。王穎等[78]利用ITC 研究射干苷與5 種蛋白的相互作用，得到反應的化學計量比、結合常數焓變和熵等熱力學參數，結果表明射干苷與5 種蛋白（除胰蛋白酶外）發生了相互作用，生成復合物。Pattanayak 等[79]利用ITC 研究鞣花酸與人血清蛋白相互作用，兩者相互作用是自發進行的，主要作用力是疏水作用和氫鍵。Kilmister 等[80]采用等溫滴定法研究了原花青素低聚物與牛血清白蛋白的結合，原花青素低聚物的分子量影響其與牛血清白蛋白的結合，焓變和結合常數隨著低聚物尺寸的增大而增大。

5 結論與展望

蛋白質-多酚復合物可以通過共價和非共價相互作用形成，制備具有高生物活性的蛋白質-多酚復合物的常見方法是自由基接枝法。蛋白質-多酚復合物的形成受環境條件（溫度和pH）以及蛋白質和多酚的類型或結構的強烈影響，因而其表現出抗氧化活性和乳化性能也不同，實際應用時，可通過控制相互作用的多酚、蛋白質種類、比例及環境條件，調控并開發出具有良好營養、功能、感官和生物活性更好的新型食品配料產品。雖然目前此方面的研究較多，但由于多酚與蛋白質種類繁多，加上反應條件不盡相同，因此蛋白質影響酚類的確切機制與規律尚不明確統一。雖然酚類化合物的強化可以改善健康食品的特性，但在不同加工處理下，酚類化合物與食品成分（尤其是蛋白質）的相互作用可能會對復合物結構、抗氧化效率和蛋白質消化率產生較大的負面影響。因此，未來需要對不同基質和不同加工條件下的蛋白質-多酚相互作用進行更深入的研究，以指導開發富含營養和健康益處的富含酚類功能性蛋白食品。