草果甲醇溶出物抑制α-葡萄糖苷酶活性及調節血糖作用

解立斌，陳 佳，劇慧棟，胡連霞，韓愛云，俞龍泉

（石家莊學院化工學院，河北石家莊 050035）

過去三十多年間，中國糖尿病患病人數不斷增長，2015～2017 年我國18 歲以上人群糖尿病患病率為11.2%，糖尿病人群中2 型糖尿病占90%以上[1-2]。α-葡萄糖苷酶抑制劑通過抑制小腸上皮細胞絨毛膜上的α-葡萄糖苷酶的活性，延緩人體對葡萄糖的吸收，控制餐后血糖的升高，有助于防治2 型糖尿病及其并發癥[3-4]。近年來，從藥用植物中篩選天然的α-葡萄糖苷酶抑制劑成為國內外學者關注的研究熱點[5-6]。

草果（Amomum tsao-koCrevost et Lemaire），別名草果子、草果仁，為姜科（Zingiberaceae）豆蔻屬（Amomum）多年生常綠草本植物草果的成熟干燥果實。草果是一種藥食同源植物，具有健胃、消食、溫中、驅風、促進食欲等藥療作用[7]，收錄于中國藥典，在國內廣泛應用于食品香料行業。我國近10 多年來對草果化學成分、藥理作用及臨床應用等方面進行了一系列研究，發現草果可溶出芳香油，富含氨基酸、多種必需微量元素、多糖、多酚及黃酮類化合物[8-9]。國內外對其活性物質的功效研究主要集中于抗氧化活性及降血脂等方面[10-12]。關于草果甲醇溶出物中活性脂質成分抑制α-葡萄糖苷酶活性及血糖調節作用的系統研究尚未見報道。

本研究在前期對草果活性物質進行篩選的基礎上，通過體外試驗研究草果甲醇溶出物對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用，并通過動物實驗研究草果甲醇溶出物對改善空腹血糖、葡萄糖耐量以及胰島素抵抗三方面的影響，為利用該植物活性成分開發降糖新藥提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮草果 購自云南；C57BL/6 小鼠 成年雄性，SPF 級，8 周齡，體重28～32 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK（京）2016-0006；柱層層析硅膠 200～300 目 青島海洋化工廠分廠；人體α葡萄糖苷酶檢測試劑盒 上海谷研實業有限公司；阿卡波糖標準品 石家莊華榮制藥有限公司；PBS 磷酸鹽 上海雷磁·創益儀器儀表有限公司；胰島素酶聯免疫檢測試劑盒 石家莊輝端生物科技有限公司；豬油 臺灣正義食品有限公司；無水甲醇 色譜純，天津市河東區紅巖試劑廠；氯仿、丙酮、碳酸氫鈉 均為分析純，天津市恒興化學試劑制造有限公司；小鼠常規飼料 即空白組飼料，購自河北醫科大學動物實驗中心；模型組飼料 在常規飼料基礎上，添加10%的豬油[13]；草果低劑量組飼料 在模型組飼料基礎上，每公斤飼料添加100 mg 的草果甲醇溶出物；草果高劑量組飼料 在模型組飼料基礎上，每公斤飼料添加200 mg 的草果甲醇溶出物[14]。

HC-100 型高速萬能粉碎儀 浙江省永康市金穗機械制造廠；RE-52AA 型旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠；XD-1200D 型超聲波細胞粉碎機 南京先歐儀器制造有限公司；RT-6000 全自動酶標儀 美國雷杜公司；OneTouch UltraTM 快速血糖測定儀及試紙 美國強生公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 草果甲醇溶出物的制備 取新鮮草果去殼，烘干粉碎為不大于100 目粉末。稱取50 g 草果粉末，加入混合醇提液（200 mL 氯仿、400 mL 甲醇和40 mL蒸餾水）靜置12 h，均質5 min（18000 r/min），冷卻后用超聲波細胞粉碎儀粉碎10 min（功率70%，工作頻率20～25 Hz）。粉碎后混合物經真空抽濾后收集濾液，濾餅加入減半量混合醇提液（100 mL 氯仿、200 mL甲醇和20 mL 蒸餾水），按照前述方法重復萃取兩次，收集3 次濾液，加入60 g 已活化硅膠粉末，經25 ℃旋轉蒸發，得到草果脂質硅膠粉末。將此粉末樣品干法上柱（自制50?×250 mm 的200～300 目硅膠氫柱，柱中硅膠分別依次經甲醇、丙酮、氯仿4 h 活化預處理），先后用600 mL 氯仿、600 mL 丙酮、600 mL 甲醇洗脫，甲醇洗脫液經微孔濾膜（0.22 μm）過濾，再經蒸發濃縮、冷凍干燥后得到草果甲醇溶出物粉末[15-16]。

1.2.2 溶液的配制 PBS 磷酸鹽緩沖液：以蒸餾水為溶劑，制成濃度為10 mg/mL，pH 為6.8 的磷酸鹽緩沖液；α-葡萄糖苷酶溶液：以磷酸鹽緩沖液為溶劑，配制成濃度為1 U/mL 的溶液；PNPG 溶液：以磷酸鹽緩沖液為溶劑，配制成12.5 mmol/L 的溶液；草果甲醇溶出物溶液：取草果甲醇溶出物粉末，用磷酸鹽緩沖液配制成濃度為0.02、0.1、0.5、2.5、7.5 mg/mL不同反應梯度的供試品溶液；阿卡波糖溶液：取阿卡波糖標準品，用磷酸鹽緩沖液配制成濃度為0.02、0.1、0.5、2.5、7.5 mg/mL 不同反應梯度的對照品溶液；碳酸氫鈉溶液：以蒸餾水為溶劑，制成pH 為9.8的溶液。

1.2.3α-葡萄糖苷酶抑制實驗α-葡萄糖苷酶抑制實驗采用PNPG 法[17]。實驗底物為對硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG），以PNP 的生成量計算α-葡萄糖苷酶活性。取草果甲醇溶出物樣品溶液、阿卡波糖測定溶液各40 μL 至96 孔板中，加入1 U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液40 μL，混勻，于37 ℃孵育5 min；加入12.5 mmol/L 的PNPG 溶液20 μL，混勻，于37 ℃孵育30 min；加入碳酸氫鈉溶液100 μL 終止反應（此時反應總體積達200 μL）。以PBS 40 μL 為空白對照，以PBS 40 μL 代替α-葡萄糖苷酶溶液作為檢測背景以消除檢測誤差，使用酶標儀于405 nm 波長處檢測各孔的光密度（OD），按下式計算2 種待測溶液對于α-葡萄糖苷酶活性的抑制率。

1.2.4 動物實驗

1.2.4.1 實驗動物分組及造模 實驗小鼠經適應性喂養1 周后隨機分為2 組，為空白組（10 只）和模型組（40 只），空白組以常規飼料喂養，模型組以高脂飼料喂養，連續飼喂6 周后，模型組小鼠禁食不禁水14 h，按35 mg/kg?BW 腹腔注射由檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（pH4.35）配制的1%鏈脲佐菌素（Streptozotocin，STZ）溶液，72 h 后剪尾取血，以血糖儀測定空腹血糖高于11.1 mmol/L 作為建模成功的標志[18]。本實驗建模成功率為75%，將建模成功的30 只小鼠隨機分為3 組，分別為模型組、草果低劑量組、草果高劑量組，每組各10 只。各組分別給予模型組飼料、草果低劑量組飼料、草果高劑量組飼料，持續喂養6 周后實驗結束。實驗期間動物自由飲用瓶裝飲用水，動物識別采用5%苦味酸標記。

1.2.4.2 一般狀態評估 實驗期間，每天觀察小鼠毛色、飲食水、排泄以及活動等基本情況，每周稱量攝食量、飲水量和體重。

1.2.4.3 空腹血糖測定 小鼠禁食不禁水6 h 后，通過剪尾采血，測定各組小鼠的空腹血糖。從實驗第6 周開始，每2 周1 次，連續4 次。

1.2.4.4 糖耐量試驗 分別于實驗第6 和第12 周時進行葡萄糖耐量實驗。在小鼠禁食10 h 后，腹腔注射葡萄糖溶液（1.5 g/kg），分別在注射前（0 min）、注射后15、30、60 和120 min 時，通過小鼠尾部采血，使用OneTouch UltraTM 快速血糖測定儀測量血糖水平，計算血糖曲線下面積AUC[19]，計算公式：

AUC=[（BG0+BG15）+（BG15+BG30）+（BG30+BG60）×2+（BG60+BG120）×4]×0.25×0.5

式中：BGi為在第i min 時的血糖值。

1.2.4.5 胰島素抵抗評估 于實驗第13 周時，禁食10 h 后，于次日眼球后靜脈叢采血，用OneTouch UltraTM 快速血糖測定儀測定空腹血糖，剩余血液離心（3000 r/min，15 min）取血漿，利用ELISA 試劑盒測定空腹胰島素水平，基于空腹血糖和胰島素計算HOMA-β和HOMA-IR 作為表征胰島素抵抗的指標[20]，計算公式：HOMA-β（%）=[20×空腹胰島素水平（mIU/L）]/[空腹血糖水平（mmol/L）-3.5]，HOMAIR=空腹血糖（mmol/L）×空腹胰島素（μU/mL）/22.5。

1.3 數據處理

數據以平均值±標準差表示，采用SPSS19.0 軟件進行統計分析，正態分布資料兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，非正態分布資料兩組間比較采用兩獨立樣本符號秩和檢驗。多組間比較采用單因素方差分析，如各組符合方差齊性則組間兩兩比較使用SNK法，如方差不齊，則使用 Dunnett’s T3 法。P值小于0.05認為組間差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 草果甲醇溶出物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用

本研究前期針對草果活性物質進行了篩選，通過丙酮、氯仿、甲醇等對草果脂質進行分離，分別確定各活性組分的生理活性，確定草果甲醇溶出物中富含降糖活性成分[21-22]，因此本研究在前期試驗的基礎上采用甲醇溶出物作為考察對象。

由圖1 可見，草果甲醇溶出物和阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶的抑制均呈劑量依賴關系，隨著劑量的加大，抑制率增大。當草果甲醇溶出物溶液濃度為0.5 mg/mL 時，對α-葡萄糖苷酶的抑制率達到63.72%。草果甲醇溶出物對α-葡萄糖苷酶的半數抑制濃度（IC50）為0.145 mg/mL，阿卡波糖為0.273 mg/mL，IC50的差異表明草果甲醇溶出物對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用強于阿卡波糖。

圖1 草果甲醇溶出物和阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶活力的抑制作用（n=3）Fig.1 Inhibitory effect of methanol extracts from Amomum tsao-ko and acarbose on the activity of α-glucosidase (n=3)

2.2 動物實驗結果

2.2.1 對小鼠攝食量、飲水量和體重的影響 由表1可見，與空白組相比，模型組在連續高脂飼料喂養6 周后，小鼠攝食量、飲水量、體重都顯著增加，差異有統計學意義（P<0.05），印證了模型的有效性。本研究以小鼠腹腔注射STZ 溶液72 h 后采血測定空腹血糖高于11.1 mmol/L 為建模成功的標志。12 周時模型組小鼠的飲水量、體重均顯著（P<0.05）高于空白組，說明小鼠糖脂代謝紊亂狀態未得到緩解。經每天飼喂草果低、高劑量組飼料干預6 周后，即在實驗第12 周時，草果低劑量組和草果高劑量組小鼠的攝食量、飲水量都低于模型組（P<0.05），但仍高于空白組（P<0.05）。草果低劑量組和草果高劑量組小鼠的體重變化不明顯，在第12 周時均顯著低于模型組（P<0.05，P<0.01），與常規飼料組相比，差異均無統計學意義（P>0.05）。說明草果甲醇溶出物可能有改善小鼠代謝，減少體內脂肪存儲量，抑制體重增長的作用[23-24]。

表1 草果甲醇溶出物對小鼠攝食量、飲水量和體重的影響（，n=10）Table 1 Effects of methanol extracts from Amomum tsao-ko on food intake,water intake and body weight in mice (,n=10)

表1 草果甲醇溶出物對小鼠攝食量、飲水量和體重的影響（，n=10）Table 1 Effects of methanol extracts from Amomum tsao-ko on food intake,water intake and body weight in mice (,n=10)

注：#表示與空白組比較，P<0.05，##表示與空白組比較，P<0.01；*表示與模型組比較，P<0.05，**表示與模型組比較，P<0.01；圖2～圖3、表2同。

2.2.2 對小鼠空腹血糖的影響 由圖2 可見，空白組小鼠比較穩定地維持空腹血糖低水平，模型組、草果低劑量組、草果高劑量組的空腹血糖值在4 個觀察點上均極顯著高于空白組（P<0.01）。當給予低、高劑量的草果甲醇溶出物干預2 周后，即實驗第8 周，草果低、高劑量組小鼠的空腹血糖值開始下降，且均低于模型組。經干預6 周后，低劑量組小鼠空腹血糖與模型組比較差異無統計學意義，高劑量組空腹血糖顯著低于模型組（P<0.05），這應與草果甲醇溶出物能抑制寡糖分解為單糖，減少腸腔對葡萄糖的吸收相關[25]。但草果低、高劑量組空腹血糖仍高于空白組，可見草果干預后并未逆轉空腹血糖受損，尚未能從根本上改善胰島β細胞的功能[26]。

圖2 草果甲醇溶出物對小鼠空腹血糖的影響Fig.2 Effect of methanol extracts from Amomum tsao-ko on fasting blood glucose in mice

2.2.3 對小鼠葡萄糖耐量的影響 如圖3 所示，與空白組相比，模型組在連續高脂飼料喂養6 周后，葡萄糖耐量AUC 顯著增加（P<0.01）。經低、高劑量組的草果甲醇溶出物干預6 周后，在實驗第12 周時，草果低、高劑量組小鼠AUC 均顯著低于模型組（P<0.05）。草果低劑量組小鼠AUC 顯著高于空白組（P<0.05），草果高劑量組小鼠AUC 與空白組相比，差異無統計學意義（P=0.07>0.05）。糖耐量低減主要是由于高脂飲食破壞小鼠血糖調節及脂質代謝能力[27-28]，引起糖脂代謝紊亂，草果甲醇溶出物對高脂飲食引起的糖耐量異常有一定改善作用。

圖3 草果甲醇溶出物對小鼠葡萄糖耐量的影響Fig.3 Effect of methanol extracts from Amomum tsao-ko on glucose tolerance in mice

2.2.4 對小鼠胰島素抵抗的影響 胰島素抵抗指數HOMA-IR，會隨著胰島素抵抗水平升高而升高，胰島β細胞功能HOMA-β，會隨著胰島β細胞功能降低而減少。在動物實驗第13 周對各組進行胰島素抵抗評估后發現（表2），與空白組相比，模型組小鼠出現了明顯的胰島素抵抗（P<0.001），當用高劑量草果甲醇溶出物進行干預后，其HOMA-β較模型組升高，差異有統計學意義（P<0.05），HOMA-IR 較模型組降低，差異有統計學意義（P<0.05），說明高劑量草果甲醇溶出物改善了由高脂飼料誘導的胰島素抵抗。

表2 草果甲醇溶出物對小鼠胰島素抵抗的影響（）Table 2 Effect of methanol extracts from Amomum tsao-ko on insulin resistance in mice ()

表2 草果甲醇溶出物對小鼠胰島素抵抗的影響（）Table 2 Effect of methanol extracts from Amomum tsao-ko on insulin resistance in mice ()

3 討論

天然植物中的多酚、黃酮具有較明確的降糖功效[29]。單恬恬等[30]將草果粉碎后，分別使用70%無水乙醇和超純水（1:10 料液比），經提取、凍干得到草果提取物，測得其中水提物總多酚、總黃酮含量分別為21.83±0.56、24.81±0.11 mg/g，醇提物總多酚、總黃酮含量分別為33.99±0.62、63.24±1.59 mg/g。任洪濤等[31]使用高效液相色譜法檢測草果中酚酸，發現其中原兒茶酸含量為9.12～17.42 mg/kg、原兒茶醛為7.11～15.51 mg/kg。本研究前期實驗推測，草果甲醇溶出物降糖作用可能與其所含酚類物質兒茶素（兒茶酸）有關[32]，且經福林酚法初步測定總酚含量不低于0.5 mg/g。這些研究表明從草果所含化學成分看，草果活性成分應可作為天然降糖物質進行研究。

α-葡萄糖苷酶是小腸內麥芽糖、蔗糖的水解酶，通過飲食攝入的碳水化合物在α-葡萄糖苷酶的作用下，釋放葡萄糖并經小腸吸收進入血液，是餐后血糖升高的主要原因。α-葡萄糖苷酶抑制劑則可使淀粉分解為葡萄糖的速度減慢、延緩或抑制葡萄糖的吸收，可有效的降低餐后高血糖[33]。草果屬于姜科植物，國內外有較多對姜科植物抑制α-葡萄糖苷酶作用的研究。陳浩南等[34]對高良姜的α-葡萄糖苷酶抑制作用研究中，發現高良姜中有豐富的多酚類化合物，對α-葡萄糖苷酶的IC50為14.45 mg/mL。劉富月[35]對34 種生姜中降血糖物質的篩選中，發現7 個生姜品種的乙醇提取物對α-葡萄糖苷酶抑制活性超過60%，適合作為α-葡萄糖苷酶抑制劑。吳相歡[36]對黃姜花化學成分和藥理活性的研究發現，黃姜花根莖水提物和醇提物對α-葡萄糖苷酶表現極強的抑制效果，且抑制效果均比陽性阿卡波糖好。He 等[37-38]的研究發現，草果中的多種二芳基庚烷類化合物具有α-葡萄糖苷酶抑制作用。本研究的體外試驗結果表明，草果甲醇溶出物對α-葡萄糖苷酶的IC50為0.145 mg/mL，抑制效果優于阿卡波糖，與上述研究結果一致，說明草果甲醇溶出物有明顯的α-葡萄糖苷酶抑制活性。此結果是相較團隊前期研究做出的更細化深入的探索。

空腹血糖是臨床最常用的檢測指標，可反映胰島β細胞的功能。胰島β細胞可以分泌適量胰島素，用以調節機體肌糖原和肝糖原與血液葡萄糖水平之間的平衡，長期處于高血糖狀態會影響β細胞功能，增加β細胞凋亡[24]。Christ 等[39]和Cani 等[40]的研究認為高脂飲食可間接通過影響腸粘膜通透性介導內毒素入血引起機體長期慢性炎癥與胰島素抵抗、血脂紊亂。在本研究的動物實驗中發現，當給予草果甲醇溶出物干預后，原本經高脂飼料誘導的高血糖得到了一定改善，空腹血糖值有所下降，糖耐量受損和胰島素抵抗均得到一定改善，這可能是由于草果甲醇溶出物能選擇性地影響小腸二糖水解酶中消化蔗糖的蔗糖酶，從而抑制蔗糖的吸收，通過降低循環血糖途徑對于改善胰島素抵抗，保護胰島細胞正常生理功能，起到增強糖耐量作用[26]，這與其體外試驗中表現出的α-葡萄糖苷酶抑制作用有密切的關聯。李姣[41]通過對2 型糖尿病大鼠使用草果乙醇提取物以100 mg/（kg·d）的劑量進行干預，發現干預可以降低糖尿病大鼠的空腹血糖水平，改善大鼠胰島素抵抗狀態。此結果與本研究發現草果甲醇溶出物干預具有一定的改善作用的結論一致，說明草果甲醇溶出物具有調節血糖的能力。

綜上，本文通過體外實驗研究了草果甲醇溶出物對α-葡萄糖苷酶的抑制活性，又通過動物實驗進一步驗證了其在體內對空腹血糖、糖耐量水平和胰島素抵抗的改善作用，初步明確了草果醇提物具有改善血糖的生物學活性，確定了草果降糖活性物質富集于甲醇洗脫物中。但本研究并未對草果甲醇溶出物中活性成分進行系統結構解析，在后續研究中，將進一步分析確定活性物質官能團，為草果活性物質的開發提供依據。