參苓白術散對潰瘍性結腸炎大鼠Th17/Treg免疫平衡的影響※

齊云菲,牛明了,張龍江

（1.河南中醫藥大學第二附屬醫院,河南 鄭州 450002；2.河南省中醫院,河南 鄭州 450002）

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis,UC）屬于炎癥性疾病中的一種,又稱為非特異性潰瘍性結腸炎。UC病變以結腸黏膜層潰瘍為主,可累及整個結腸,病變主要為結腸與直腸黏膜及下層彌漫性、連續性、非特異性炎癥[1]。近年來,隨著人們生活習慣與飲食結構的改變,全球UC發病率呈逐漸升高趨勢[2]。UC病程漫長,常遷延難愈,甚至可發生癌變,嚴重降低患者的生活質量[3]。目前,UC發病機制尚未完全闡明,臨床治療以糖皮質激素、免疫抑制劑、水楊酸類藥物及抗生素為主,雖可緩解相關癥狀,但長期使用存在嚴重的不良反應,患者依存性差,且停藥后易復發。中醫治療疾病重視辨證論治,標本兼治,不僅療效良好,且不良反應少。參苓白術散常用于治療脾胃氣虛、濕阻氣滯證,是臨床治療UC的常用方劑,療效確切[4]。實驗研究表明,參苓白術散可改善UC模型大鼠的癥狀、體征,調節血清炎癥因子表達,減輕UC腸黏膜損傷[5]。本研究通過建立UC大鼠模型,觀察參苓白術散對UC大鼠血清白細胞介素-6（IL-6）、白細胞介素-10（IL-10）、Th17和Treg細胞水平及相關轉錄因子表達的影響,以探討參苓白術散改善UC的作用機制。

1 實驗材料

1.1 動物 選擇SPF級SD大鼠60只,體質量160～180 g,由河南省實驗動物中心提供,動物生產合格證:SYXK（豫）2018-0014。本研究經河南中醫藥大學實驗動物倫理委員會批準（審批號:DWLL2018030032）。

1.2 藥品與試劑 中藥由河南中醫藥大學第二附屬醫院中藥房提供,參苓白術散處方:麩炒白術、山藥、茯苓、白參各15 g,白扁豆12 g,蓮子肉、麩炒薏苡仁各10 g,炙甘草9 g,砂仁（后下）、桔梗各6 g。美沙拉嗪（牡丹江恒遠藥業股份有限公司）,水合氯醛（天津市科密歐化學試劑有限公司）,5%三硝基苯磺酸（TNBS,Sigma公司）,IL-6酶聯免疫吸附試驗試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司）,IL-10酶聯免疫吸附試驗試劑盒（武漢基因美生物科技有限公司）,RIPA裂解液（上海碧云天生物技術有限公司）,增強型化學發光劑（ECL）Prime蛋白印跡試劑（賽默飛世爾科技有限公司）,RORγt抗體（北京博奧森生物技術有限公司）,β-肌動蛋白（β-actin）抗體、HRP-羊抗大鼠二抗、FoxP3抗體（武漢愛博泰克生物科技有限公司）。

1.3 儀器 TGL-16C型高速離心機（上海安亭科學儀器廠）,全自動酶標儀（美國Bio-Tek公司）,CytoFLEX流式細胞儀（美國Beckman公司）,AE160型精密天平秤（Mettler公司）,蛋白印跡電泳系統（北京六一儀器廠）。

2 實驗方法

2.1 藥物制備 將參苓白術散先浸泡30 min,再加水煎煮2次,合并2次藥液,并濃縮至含生藥2.26 g/m L。

2.2 分組與造模 將60只SPF級SD大鼠適應性喂養1周后隨機分為空白組、模型組、參苓白術散低劑量組、參苓白術散中劑量組、參苓白術散高劑量組和沙美拉嗪組,每組10只。除空白組外,其余5組大鼠均采用TNBS-乙醇灌腸法造模。大鼠造模前禁食不禁水24 h,以300 mg/kg水合氯醛進行腹腔注射麻醉,然后用2 mm的硅膠管插入大鼠肛門約5 cm處,緩慢注入5%TNBS＋50%乙醇,劑量為0.02 m L/kg,灌注結束后,輕柔大鼠腹部并提起尾巴,使其頭部朝下10 min,待其清醒后正常喂養,若動物出現黏液膿血便、腹瀉,則造模成功。空白組大鼠除5%TNBS替換為0.9%氯化鈉注射液外,其余操作與造模大鼠相同。

2.3 給藥 根據動物體表系數換算法得出大鼠參苓白術散用量為22.6 g/kg。參苓白術散低、中、高劑量組分別給予11.3、22.6、45.2 g/kg參苓白術散水煎液灌胃,美沙拉嗪組給予0.4 g/kg美沙拉嗪灌胃,空白組與模型組分別給予與美沙拉嗪組等體積0.9%氯化鈉注射液灌胃,連續給藥14 d。

2.4 取材 大鼠給藥14 d后禁食12 h,用300 mg/kg水合氯醛進行腹腔注射麻醉,腹主動脈取血,離心、收集血清,置于－80℃冰箱凍存。另取結腸組織,用0.9%氯化鈉注射液沖洗后置于－80℃冰箱凍存。

2.5 實驗指標 ①疾病活動指數（DAI）:主要觀察大鼠體質量、糞便性狀及直腸出血情況。評分標準:體質量下降率＜1%計0分,下降率1%～5%計1分,下降率6%～10%計2分,下降率＞10%計3分；糞便顆粒與硬度適中計0分,糞便顆粒成形、較軟、不黏附肛門計1分,糞便顆粒柔軟且黏附肛門計2分,糞便不成形、黏附肛門、腹瀉計3分；糞便無異常計0分,糞便有暗紅色斑點計1分,糞便有暗紅色斑點、肛門可見出血計3分,糞便深紅色、肛門周圍有血液黏附計3分。DAI評分＝（體質量下降率評分＋糞便評分＋大便潛血評分）/3,于給藥第7、14日進行評定。②血清IL-6、IL-10水平:采用酶聯免疫吸附試驗法測定。③大鼠外周血Th17、Treg細胞水平及Th17/Treg值:給藥14 d后取大鼠尾靜脈血,用機械法獲取單個核細胞懸液,加入細胞分離液,2 000 r/min離心20 min,去掉中間單個核細胞,計數并稀釋到所需濃度,分別加入相應抗體,用流式細胞儀檢測。④結腸組織RORγt、FoxP3表達:提取結腸組織總蛋白,分裝,－20℃保存,根據標準蛋白濃度和相應的OD值計算直線回歸方程,求出樣品蛋白濃度。制膠、電泳、轉膜,用含5%脫脂奶粉的緩沖液室溫搖床封閉2 h,加入一抗（RORγt或FoxP3抗體）,4℃孵育過夜,清洗后加入二抗（HRP-羊抗大鼠抗體）,37℃搖床孵育2 h,清洗多余二抗,ECL顯色,用BandScan軟件分析膠片灰度值。

2.6 統計學方法 采用SPSS 25.0統計軟件分析數據,計量資料符合正態分布時以均數±標準差（±s）表示,多組間數據使用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 DAI評分比較 藥7 d后,參苓白術散中、高劑量組及美沙拉嗪組DAI評分均低于模型組（P＜0.05）,參苓白術散高劑量組與美沙拉嗪組比較無顯著差異（P＞0.05）。給藥14 d后,參苓白術散各組及美沙拉嗪組DAI評分均低于模型組（P＜0.05）,且參苓白術散高劑量組高于美沙拉嗪組（P＜0.05）。見表1。

表1 6組大鼠不同治療時間疾病活動指數評分比較(分,±s)

表1 6組大鼠不同治療時間疾病活動指數評分比較(分,±s)

注:與模型組同期比較,▲P＜0.05；與參苓白術散高劑量組同期比較,*P＜0.05。

組別 只數 給藥7 d后評分 給藥14 d后評分空白組 10 － －模型組 10 2.32±0.13 2.46±0.18參苓白術散低劑量組 10 2.14±0.20 1.98±0.15▲參苓白術散中劑量組 10 2.00±0.10▲ 1.72±0.12▲參苓白術散高劑量組 10 1.86±0.17▲ 1.54±0.18▲美沙拉嗪組 10 1.72±0.12▲ 1.12±0.12▲*

3.2 血清IL-6、IL-10水平比較 給藥14 d后,模型組血清IL-6水平高于空白組（P＜0.05）,參苓白術散各組及美沙拉嗪組均低于模型組（P＜0.05）,參苓白術散中、高劑量組高于美沙拉嗪組（P＜0.05）；模型組IL-10水平低于空白組（P＜0.05）,參苓白術散中、高劑量組及美沙拉嗪組均高于模型組（P＜0.05）,參苓白術散中、高劑量組與美沙拉嗪組比較無顯著差異（P＜0.05）。見表2。

表2 6組大鼠給藥14 d后血清白細胞介素-6、白細胞介素-10水平比較(ng/g,±s)

表2 6組大鼠給藥14 d后血清白細胞介素-6、白細胞介素-10水平比較(ng/g,±s)

注:與空白組比較,△P＜0.05；與模型組比較,▲P＜0.05；與參苓白術散高劑量組比較,*P＜0.05。

組別 只數 白細胞介素-6 白細胞介素-10空白組 10 46.23±7.01 12.95±1.30模型組 10 260.31±7.01△ 7.75±0.16△參苓白術散低劑量組 10 195.04±5.17▲ 8.58±0.81參苓白術散中劑量組 10 144.80±7.44▲ 9.70±0.34▲參苓白術散高劑量組 10 113.13±5.33▲ 10.96±0.57▲美沙拉嗪組 10 88.06±2.36▲*12.03±0.74▲

3.3 外周血Th17、Treg細胞水平及Th17/Treg值比較 給藥14 d后,模型組外周血Th17細胞水平及Th17/Treg值均高于空白組（P＜0.05）,參苓白術散各組及美沙拉嗪組均低于模型組（P＜0.05）,參苓白術散中、高劑量組高于美沙拉嗪組（P＜0.05）；模型組Treg細胞水平低于空白組（P＜0.05）,參苓白術散各組及美沙拉嗪組高于模型組（P＜0.05）,參苓白術散高劑量組高于美沙拉嗪組（P＜0.05）。見表3。

表3 6組大鼠給藥14 d后外周血Th17、Treg細胞水平及Th17/Treg值比較(±s)

表3 6組大鼠給藥14 d后外周血Th17、Treg細胞水平及Th17/Treg值比較(±s)

注:與空白組比較,△P＜0.05；與模型組比較,▲P＜0.05；與參苓白術散高劑量組比較,*P＜0.05。

組別 只數 Th17（%） Treg（%） Th17/Treg值空白組 10 1.67±0.14 2.98±0.09 0.56±0.06模型組 10 6.17±0.36△ 0.85±0.18△ 7.54±1.63△參苓白術散低劑量組 10 4.20±0.04▲ 1.46±0.14▲ 2.90±0.25▲參苓白術散中劑量組 10 3.30±0.18▲ 2.05±0.19▲ 1.63±0.22▲參苓白術散高劑量組 10 2.67±0.12▲ 2.19±0.12▲ 1.22±0.04▲美沙拉嗪組 10 2.11±0.17▲*2.51±0.11▲*0.85±0.08▲*

3.4 結腸組織RORγt、Fox P3表達水平比較 給藥14 d后,模型組結腸組織RORγt表達水平高于空白組（P＜0.05）,參苓白術散中、高劑量組和美沙拉嗪組均低于模型組（P＜0.05）,參苓白術散高劑量組高于美沙拉嗪組（P＜0.05）；模型組結腸組織FoxP3表達水平低于空白組（P＜0.05）,參苓白術散各組和美沙拉嗪組高于模型組（P＜0.05）,但組間比較無顯著差異（P＞0.05）。見表4、圖1（圖1見標題處二維碼）。

表4 6組大鼠給藥14 d后結腸組織RORγt、FoxP3蛋白表達水平比較(±s)

表4 6組大鼠給藥14 d后結腸組織RORγt、FoxP3蛋白表達水平比較(±s)

注:與空白組比較,△P＜0.05；與模型組比較,▲P＜0.05；與參苓白術散高劑量組比較,*P＜0.05。

組別 只數 RORγt FoxP3空白組 10 0.056 6±0.003 5 0.676 4±0.048 4模型組 10 0.183 8±0.003 0△ 0.176 8±0.012 3△參苓白術散低劑量組 10 0.161 8±0.005 2 0.430 6±0.019 8▲參苓白術散中劑量組 10 0.132 0±0.003 9▲ 0.561 6±0.032 3▲參苓白術散高劑量組 10 0.106 6±0.004 0▲ 0.594 4±0.059 3▲美沙拉嗪組 10 0.080 0±0.005 7▲*0.637 4±0.047 1▲

4 討論

研究顯示,UC的發病機制較為復雜,通常認為與遺傳、飲食、免疫等因素有關,其中免疫反應失調是UC發病的重要因素,過度的免疫活動是UC發病的最終環節。當腸道出現過度的免疫活動時,促炎細胞因子與抑炎細胞因子表達失衡,巨噬細胞釋放IL-6、白細胞介素-8（IL-8）、白細胞介素-18（IL-18）等促炎細胞因子損傷消化道,破壞腸黏膜屏障,產生免疫損傷效應,導致UC發生[6]。西醫治療UC的藥物包括水楊酸制劑、皮質類固醇、免疫抑制劑、生物制劑等,雖起效快,但無法根治,激素依賴及抵抗、不良反應、耐藥性等難題亟待解決[7]。

UC歸屬于中醫“痢疾”“腸癖”“久痢”等范疇,多因脾肺氣虛導致氣機不暢、瘀血內生而致。脾虛則運化失司,機體津液代謝障礙,形成痰濕,痰濕與瘀血互結,困于腸道,使腸絡瘀阻,出現血敗肉腐、腸腑潰結之證。該病屬本虛標實之證,本虛為脾肺氣虛,標實為濕熱瘀毒蘊結腸道[8]。參苓白術散是臨床治療脾虛濕盛證的代表方劑之一,出自《太平惠民和劑局方》,具有益氣健脾、祛濕止瀉功效,契合UC病機[9]。本研究結果顯示,參苓白術散干預后,中、高劑量組DAI評分顯著降低,提示適宜劑量的參苓白術散可有效減輕UC模型大鼠的病變程度。

Th17介導炎性反應,Treg介導免疫耐受與自穩,兩者功能相反,處于動態平衡,二者失衡則導致機體免疫力和抗炎能力下降,引發各種炎癥性疾病[10]。研究發現,Th17/Treg失衡參與了腸道疾病的發生與發展,在炎癥性腸病中,Th17/Treg值與病情程度密切相關[11]。Th17可通過介導炎性反應,促進炎癥細胞因子分泌,如IL-6、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等,導致組織炎性浸潤和組織破壞,出現腸黏膜損傷[12]。而Treg可分泌IL-10等抗炎細胞因子,具有抑制炎性反應等作用[13]。研究顯示,RORγt是Th17分化的重要轉錄因子,而FoxP3是公認的CD4＋CD25＋Treg細胞特異性標志因子[14]。當IL-6等細胞因子功能亢進時,RORγt表達升高,而Fox P3表達降低,造成 Th17/Treg向Th17傾斜,使促炎作用增強[15]。李姿慧等[16]研究發現,參苓白術散可降低UC模型大鼠血清IL-6水平,控制大鼠的炎性反應,減少結腸黏膜充血、水腫及潰瘍形成,改善腸黏膜損傷。本研究結果顯示,與空白組相比,模型組大鼠血清IL-6水平、結腸組織RORγt表達及外周血Th17/Treg值顯著升高,血清IL-10水平、FoxP3表達水平顯著降低。參苓白術散干預后,大鼠血清IL-6水平、結腸組織RORγt表達水平及外周血Th17/Treg值明顯下調,血清IL-10水平、結腸組織FoxP3表達水平明顯上調,提示參苓白術散可能通過調節RORγt、FoxP3表達,進而糾正UC大鼠Th17/Treg失衡現象,緩解炎性反應,達到治療UC的目的。

中醫運用辨證論治,注重整體觀念,對UC的治療具有療效確切、不良反應小等優勢,但仍存在問題,如參苓白術散為復方,成分復雜,其確切的抗UC成分及作用機制還有待進一步深入研究。