CD28基因在爆震致腸道損傷中作用及機制

劉 穎， 叢培芳， 史秀云， 馬瑞珩， 金紅旭

北部戰區總醫院 急診醫學科，遼寧 沈陽 110016

爆炸可造成機體多器官損傷，其嚴重程度與爆炸物的類型和數量、距離爆炸點的距離、爆炸環境、受害者的防護情況及健康狀況等有關[1]。爆炸瞬間沖擊波作用于不同密度交界面后，通過內爆、剝落、慣性、負壓等效應導致組織器官損傷，其中以空腔器官(如耳、肺、胃腸等)損傷最為嚴重[2-3]。0.3%～0.6%爆震傷幸存者會發生胃腸道損傷，出現不同性質和強度的疼痛、惡心、嘔吐、腹瀉、里急后重、便血、嘔血、腸鳴音消失、壓痛、反跳痛等。胃腸道沖擊傷還會導致延遲性胃腸道穿孔。爆震致腸道損傷常被腦、胸部及四肢等嚴重損傷所掩蓋，造成診斷延誤。但目前對爆震致腸道損傷的特點、相關基因和蛋白在其中的作用及機制尚不清楚[4-5]。本研究旨在探討CD28基因在爆震致腸道損傷中的作用及機制?，F報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 16只健康雄性C577BL/6小鼠購自遼寧長生生物科技有限公司；16只健康雄性CD28基因敲除小鼠來自杰克遜實驗室(薩克拉門托，美國)。小鼠體質量(22±3)g，適應性飼養7 d后，將C577BL/6小鼠隨機分入正常對照組(n=8)和爆震傷模型組(n=8)，將CD28基因敲除小鼠隨機分入CD28基因缺失組(n=8)和PI3K抑制劑組(n=8)。模型建立時，爆震傷模型組、CD28基因缺失組、PI3K抑制劑組小鼠腹部直接接受沖擊波損傷，實驗瞬時沖擊波超壓為(342±32)PSI。PI3K抑制劑組Ly294002通過小鼠腹腔注射100 mM溶于100 μl生理鹽水。

1.2 小鼠觀察和體質量測量 模型建立前后每日觀察小鼠狀態，模型建立前后每日測量小鼠體質量2次并取得平均值，記錄小鼠體質量變化趨勢。

1.3 HE染色 爆震48 h后，取各組小鼠腸道組織，生理鹽水清洗后置于福爾馬林中固定，脫水包埋并切成5 μm厚組織切片，梯度脫蠟后，蘇木素染色3.0 min，伊紅染液染色1.5 min，二甲苯和梯度酒精透明，封片后顯微鏡下觀察并拍照。

1.4 TUNEL檢測 爆震48 h后，取各組小鼠腸道組織，生理鹽水清洗后置于福爾馬林中固定，脫水包埋并切成4 μm厚組織切片，根據TUNEL檢測試劑盒說明書步驟進行染色，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.5 Western-blot檢測 取凍存腸道組織提取總蛋白進行濃度測定后，進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉模封閉后，分別用丙二醛(malonaldehyde，MDA)(Rabbit monoclonal，1∶1 000)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)-1(Rabbit monoclonal，1∶1 000)、SOD-2(Rabbit monoclonal，1∶1 000)、Phospho-PI3 Kinase p85(Rabbit monoclonal，1∶1 000)、AKT(Rabbit monoclonal，1∶1 000)、Nrf2(Rabbit monoclonal IgG，1∶1 000)及GAPDH(Mouse monoclonal IgG，1∶1 000)4℃孵育過夜，相應二抗室溫孵育1.5 h后采用ECL發光系統進行蛋白顯影及灰度測定。

2 結果

2.1 小鼠觀察和體質量測量 建模前：各組小鼠狀態良好，飲食和排便正常。建模后：爆震傷模型組小鼠活動減少，無排便或排便稀軟；與爆震傷模型組比較，CD28基因缺失組小鼠活動狀態和排便趨于正常；PI3K抑制劑組狀態與爆震傷模型組接近。爆震傷模型組小鼠建模前和建模后24、48 h的體質量分別為(23.7±3.5)g、(19.3±2.8)g、(18.4±2.9)g，呈持續降低趨勢(P<0.05)；CD28基因缺失組小鼠建模前和建模后24、48 h的體質量分別為(23.1±2.6)g、(22.2±3.7)g、(23.8±3.3)g，先降低后升高，比爆震傷模型組更趨近于正常(P<0.05)；PI3K抑制劑組小鼠建模前和建模后24、48 h的體質量分別為(23.5±3.2)g、(19.6±3.1)g、(18.9±2.5)g，變化趨勢與爆震傷模型組相近(P>0.05)。

2.2 HE染色和TUNEL檢測結果 爆震傷模型組小鼠腸道黏膜結構松散破壞，可見明顯腸道損傷，絨毛發生萎縮和斷裂，炎癥細胞浸潤明顯，上皮樣腺體數量減少；CD28基因缺失組小鼠腸道組織結構趨向于正常，形態結構相對整齊，與爆震傷模型組比較，炎癥細胞浸潤減少，腸道絨毛高聳，上皮、黏膜及絨毛損傷減輕；PI3K抑制劑組小鼠腸道變化趨近于爆震傷模型組。爆震傷模型組小鼠凋亡細胞的紅色熒光強度高于CD28基因缺失組，即爆震可致小鼠腸道組織凋亡損傷；PI3K抑制劑組小鼠腸道組織凋亡損傷程度趨近于爆震傷模型組。見圖1。

圖1 HE染色和TUNEL檢測結果(a.HE染色，b.TUNEL檢測)

2.3 Western-blot檢測 與正常對照組小鼠比較，爆震傷模型組腸道組織中MDA蛋白表達升高，SOD-1和SOD-2蛋白表達降低(P<0.05)；與爆震傷模型組小鼠比較，CD28基因缺失組MDA蛋白表達降低，SOD-1和SOD-2蛋白表達升高(P<0.05)；PI3K抑制劑組MDA、SOD-1、SOD-2蛋白表達趨近于爆震傷模型組(P>0.05)。見圖2。與正常對照組小鼠比較，爆震傷模型組腸道組織中PI3K、AKT、Nrf2通路蛋白表達升高(P<0.05)；與爆震傷模型組小鼠比較，CD28基因缺失組PI3K、AKT、Nrf2通路蛋白表達升高(P<0.05)；PI3K抑制劑組小鼠PI3K、AKT、Nrf2通路蛋白表達低于CD28基因缺失組(P<0.05)，趨近于爆震傷模型組(P>0.05)。見圖3。

圖2 各組MDA、SOD-1、SOD-2蛋白表達

圖3 各組PI3K、AKT、Nrf2通路蛋白表達

3 討論

爆震受害者通常具有復雜的臨床表現，因其傷害直接或間接地與爆炸產生的沖擊波有關。這些傷害取決于爆炸裝置的類型、爆炸時的環境、受害者的情況等[6]。爆震沖擊波作用于機體可造成空腔臟器的嚴重損傷，機制較為復雜。體外的爆炸能轉化為生物動力能，在超壓下對腹部造成損傷；此外，當壓力瞬態與機體相互作用時，部分激波被反射，但大多被吸收，軟組織、血管及充滿空氣或液體的腔室(如肺、腸、腦等)之間的界面特別容易受到損傷。臟器發生損傷后，相關的蛋白改變同樣在爆震損傷中發揮重要作用[7-8]。CD28是免疫應答啟動、維持及下調中的關鍵因素。有研究表明，CD28可刺激T細胞，除T細胞受體外，還會為各種白細胞介素的產生提供強有力的信號，引發炎癥反應瀑布[9]。CD28拮抗劑能夠明顯降低白細胞介素-6、環氧化酶-2的表達和巨噬細胞的數量，減輕輻射引起的小鼠腸道損傷。既往研究發現，CD28基因缺失可減輕胸部沖擊波暴露導致的腦部損傷，因此，CD28基因在沖擊波導致的炎癥反應、繼發的氧化應激和凋亡中均發揮重要作用[10]。本研究同樣證實，CD28基因通過PI3K/AKT/Nrf2通路參與爆震致腸道氧化應激和凋亡損傷，且在給予PI3K抑制劑后相關作用減弱。作為細胞內信號轉導酶的一個家族，PI3K參與多種細胞功能，如細胞增殖、分化、存活及細胞內運輸等。作為一種上游信號，CD28能夠募集PI3K、Grb2、Gads等相關蛋白，通過調節一系列抗氧化劑和細胞應激基因參與氧化應激和細胞凋亡反應[11-12]。正常條件下，Nrf2通過快速泛素化和蛋白酶體依賴性降解維持在低水平?；钚匝醯倪^度積累會影響多種細胞內信號通路，從而促進細胞解離Nrf2。隨后，CAT、TRX、SOD、NADPH脫氫酶醌1等氧化劑和抗氧化酶被進一步激活[13]。本研究中，在爆炸暴露后，腸內氧化酶和抗氧化酶水平發生了明顯變化，反映了腸組織中的氧化應激反應，而CD28基因敲除可以減弱這些變化。

綜上所述，CD28基因在爆震致腸道損傷中發揮重要作用，其機制可能與PI3K/AKT/Nrf2通路有關，該通路相關蛋白可為爆震致腸道損傷的進一步救治策略研究提供相應基因和蛋白靶點。