提高畜禽產(chǎn)品中環(huán)丙沙星、達(dá)氟沙星、恩諾沙星、沙拉沙星獸殘檢測回收率的方法研究

劉小冬

（北京市順義區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 100300）

由于環(huán)丙沙星、達(dá)氟沙星等氟喹諾酮類藥物在養(yǎng)殖環(huán)節(jié)使用較為普遍，由此造成的耐藥性問題也較突出，根據(jù)我國GB 31650—2019中的規(guī)定此四種獸藥殘留在肌肉組織中不得超過100μg/kg，因此在藥殘檢測領(lǐng)域針對畜禽產(chǎn)品中四種沙星的檢測也很普遍，但某些地方的農(nóng)產(chǎn)品綜合檢測機(jī)構(gòu)由于開展畜產(chǎn)品獸殘檢測時(shí)間較短，在開展此類獸藥殘留檢測方法的新方法確認(rèn)工作時(shí)，回收率常常不合格，但又不知如何去分析原因，影響了一些農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)檢機(jī)構(gòu)的認(rèn)證工作。由于使用的是添加回收的方法來測試回收率，因此提取環(huán)節(jié)對于實(shí)驗(yàn)回收率的影響本文不做詳細(xì)探討分析。本文重點(diǎn)針對實(shí)驗(yàn)中影響回收率很大的萃取柱凈化環(huán)節(jié)進(jìn)行數(shù)據(jù)記錄和分析，將上樣后的液體、淋洗液、洗脫液收集后進(jìn)行上機(jī)檢測，從而全盤分析得出回收率損失發(fā)生在何種環(huán)節(jié)，以此分析出回收率損失的原因，從而更快速有效的提升檢測水平。

1 試驗(yàn)材料

1.1 標(biāo)準(zhǔn)品

環(huán)丙沙星（ 德國DR）、達(dá)氟沙星（ 德國DR）、恩諾沙星（德國DR）、沙拉沙星（ 德國DR）。

1.2 主要試劑

甲醇 、乙腈（ 色譜純 JT.Baker）；磷酸 、三乙胺、磷酸二氫鉀、0.03mol氫氧化鈉（分析純 北京化學(xué)試劑公司） 。

1.3 主要儀器設(shè)備

高效液相色譜儀（熒光檢測器）1260 Infinity 美國Agilent

Bond ElutC18固相萃取柱100mg 3mL 美國Agilent

固相萃取裝置 美國Agilent

高速冷凍離心機(jī) 韓國hanil

組織勻漿機(jī) 江蘇金壇榮華儀器制造有限公司

十萬分之一電子天平 OHAUS

50mL離心管 Thermo

10mL離心管 Thermo

移液器100μL/1mL/5mL/10mL eppendorf

上機(jī)小瓶2mL 美國Agilent

2 試驗(yàn)方法

2.1 標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液和工作液的配制

用十萬分之一電子天平分別稱取約25mg的環(huán)丙、達(dá)氟、恩諾、沙拉沙星標(biāo)準(zhǔn)品，用0.03mol的氫氧化鈉溶解后分別配成50mL的單標(biāo)儲備液，并精確稀釋成500μg/mL的濃度的單標(biāo)儲備液。將4種500μg/mL的單標(biāo)儲備液，各取10mL單標(biāo)儲備液再加10mL乙腈得到50mL濃度為100μg/mL的混標(biāo)儲備液。吸取100μg/mL混標(biāo)儲備液100μL加入9900μL的乙腈溶液后稀釋液得到10mL濃度為1μg/mL的喹諾酮標(biāo)準(zhǔn)品工作液。工作液現(xiàn)配現(xiàn)用，7d內(nèi)有效。

2.2 上清液制備和加標(biāo)

分別稱取2g空白豬肉樣品加入5個(gè)50mL離心管中，加入磷酸鹽緩沖液勻漿、震蕩、離心。每個(gè)離心管中吸取9mL上清液共45mL上清液混勻備用。向45mL上清液中加入45μL 100μg/mL的混標(biāo)儲備液。得到添加濃度為100μg/kg的加標(biāo)溶液。

2.3 萃取柱活化

取9根Bond ElutC18固相萃取柱（100mg 3mL）分別標(biāo)注A1、A2、A3、B1、B2、B3、C1、C2、C3。以相同條件先后用甲醇、磷酸鹽緩沖液各2mL預(yù)洗。

2.4 不同流速的上樣試驗(yàn)

將9根固相萃取柱分成三組，第一組A1、A2、A3，第二組B1、B2、B3，第三組C1、C2、C3，每個(gè)萃取柱均加入5mL加標(biāo)溶液，但以不同流速進(jìn)行上樣，其中第一組A1、A2、A3讓加標(biāo)溶液以大約3～4s一滴的自然流速上樣過柱，第二組B1、B2、B3用洗耳球慢速擠壓使加標(biāo)溶液以大約2s一滴的流速上樣過柱，第三組C1、C2、C3用洗耳球快速擠壓使加標(biāo)溶液以大約1s一滴的流速上樣過柱，用10mL離心管分別標(biāo)注A1、A2、A3、B1、B2、B3、C1、C2、C3后置于萃取柱下方，用以接收上樣過柱后的溶液，上樣結(jié)束后將上述離心管中溶液進(jìn)行渦旋，分別取1mL注入標(biāo)注為A1、A2、A3、B1、B2、B3、C1、C2、C3的9個(gè)上機(jī)小瓶中，上機(jī)檢測讀取本應(yīng)廢棄的上樣后液體的目標(biāo)物的濃度，從而對比不同流速過柱后回收率的損失情況。

2.5 不同流速的淋洗試驗(yàn)

在9支萃取柱中分別加入1mL水以不同流速進(jìn)行淋洗并擠干。其中第一組A1、A2、A3以大約3～4s一滴的自然流速淋洗過柱，第二組B1、B2、B3用洗耳球慢速擠壓使加標(biāo)溶液以大約2s一滴的流速淋洗過柱，第三組C1、C2、C3用洗耳球快速擠壓使加標(biāo)溶液以大約1s一滴的流速淋洗過柱，用10mL離心管分別編號E1、E2、E3、F1、F2、F3、G1、G2、G3后置于萃取柱下方，用以接收淋洗液，淋洗結(jié)束后將上述離心管中溶液進(jìn)行渦旋，分別注入編號為E1、E2、E3、F1、F2、F3、G1、G2、G3的9個(gè)上機(jī)小瓶中，上機(jī)檢測本應(yīng)廢棄的淋洗液中是否含有目標(biāo)組分物質(zhì)，從而對比不同流速淋洗對回收率損失的影響。

2.6 不同比例的洗脫液的洗脫試驗(yàn)

取9根固相萃取柱分別標(biāo)注I1、I2、I3、J1、J2、J3、K1、K2、K3后，以相同條件，即相同的自然流速加入5mL加標(biāo)溶液上樣，以相同流速加入1mL水進(jìn)行淋洗，分別擠干。將9根固相萃取柱分成三組，第一組I1、I2、I3，第二組J1、J2、J3，第三組K1、K2、K3，三組固相萃取柱按照不同的洗脫液比例均吸取1mL洗脫液進(jìn)行洗脫并擠干，其中第一組洗脫液中磷酸/三乙胺和乙腈含量比82∶18，第二組洗脫液中磷酸/三乙胺和乙腈含量比75∶25，第三組洗脫液中磷酸/三乙胺和乙腈含量比70∶30。將編號為I1、I2、I3、J1、J2、J3、K1、K2、K3的離心管置于萃取柱下方收集洗脫液，分別渦旋過膜后注入編號I1、I2、I3、J1、J2、J3、K1、K2、K3的9個(gè)上機(jī)小瓶中，上機(jī)檢測讀取目標(biāo)物的濃度，從而比對不同洗脫液比例對洗脫四種沙星物質(zhì)的洗脫效果。

2.7 不同的洗脫體積的洗脫試驗(yàn)

取3根固相萃取柱分別標(biāo)注L1、L2、L3后，以相同條件，即相同的自然流速加入5mL加標(biāo)溶液上樣，以相同流速加入1mL水進(jìn)行淋洗擠干后，以相同含量的洗脫溶液（磷酸三乙胺和乙腈含量比70∶30）進(jìn)行洗脫。將3根固相萃取柱用1mL洗脫液進(jìn)行洗脫并擠干，收集洗脫液后分別置于編號為L1、L2、L3的上機(jī)小瓶中，上機(jī)讀取目標(biāo)物濃度，從而分析洗脫效果。在三根萃取柱中繼續(xù)加入1mL洗脫液進(jìn)行洗脫并擠干，繼續(xù)收集洗脫液后分別置于編號為M1、M2、M3的上機(jī)小瓶中，上機(jī)讀取目標(biāo)物濃度，觀察第二次1mL洗脫效果。在三根萃取柱中繼續(xù)加入2mL洗脫液進(jìn)行洗脫并擠干，繼續(xù)收集洗脫液后分別置于編號為N1、N2、N3的上機(jī)小瓶中，上機(jī)讀取四種沙星物質(zhì)濃度，觀察第三次2mL洗脫液的洗脫效果。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同流速下的上樣試驗(yàn)結(jié)果與數(shù)據(jù)分析

如表1所示。

如表1所示，以自然流速上樣的A組三個(gè)平行樣品上樣后液體中環(huán)丙、恩諾、沙拉沙星未檢測到，達(dá)氟沙星有微量損失。用洗耳球慢速擠壓的B組三個(gè)平行樣品上樣后液體中環(huán)丙沙星和沙拉沙星未檢出，達(dá)氟沙星和恩諾沙星損失變大。用洗耳球快速擠壓的C組三個(gè)平行樣品上樣后液體中四種沙星均能檢出，說明此種操作下?lián)p失最大。由此可見，上樣的流速要進(jìn)行適當(dāng)控制不能過快，過快的流速可能妨礙了萃取柱對目標(biāo)組分的吸收和攔截效率，造成目標(biāo)物的損失。

3.2 不同流速的淋洗試驗(yàn)結(jié)果與數(shù)據(jù)分析

如表2所示，以自然流速淋洗的E組三個(gè)平行樣品淋洗液中環(huán)丙、達(dá)氟、恩諾、沙拉沙星均未檢出。用洗耳球慢速擠壓的F組三個(gè)平行樣品淋洗液中四種目標(biāo)組分未檢出。用洗耳球快速擠壓的G 組三個(gè)平行樣品淋洗液中恩諾和沙拉沙星未檢出，環(huán)丙和達(dá)氟沙星有微量檢出。由此可見，淋洗的流速也應(yīng)當(dāng)適當(dāng)控制不能求快，過快的流速可能同樣可能造成目標(biāo)物的損失影響實(shí)驗(yàn)回收率。

表2 E1-G3上機(jī)檢測結(jié)果 單位：μg/kg

3.3 不同比例的洗脫液的洗脫試驗(yàn)結(jié)果與數(shù)據(jù)分析

樣品編號 環(huán)丙沙星 達(dá)氟沙星 恩諾沙星 沙拉沙星 理論值I3 49.2 50.6 42.4 32.4 50 J1 45.8 48.8 46.8 44.4 50 J2 49.4 50.2 49.4 46.0 50 J3 49.6 50.1 54 45.6 50 K1 48.6 49.8 49.6 48.4 50 K2 49.3 50.2 49.8 48.2 50 K3 49.2 50.6 50.1 50.4 50

如表3所示，I組、J組、K組中四種沙星的洗脫液濃度隨著洗脫液中乙腈比例的提高而提高，證明了在洗脫液中降低水相比例增加有機(jī)相比例有助于提升洗脫效果，增加有機(jī)相比例后的洗脫液對目標(biāo)物中沙拉沙星洗脫效率提升尤為明顯，可以解決現(xiàn)實(shí)檢測工作中普遍存在的沙拉沙星回收率總是偏低的問題。

表3 I1-K3上機(jī)檢測結(jié)果 單位：μg/kg

3.4 不同的洗脫體積的洗脫試驗(yàn)與結(jié)果分析

如表4所示，L組用1mL洗脫液洗脫后的回收率在96%以上，但當(dāng)?shù)诙卫^續(xù)用1mL洗脫液進(jìn)行洗脫后依然能收集到微量的目標(biāo)物，而當(dāng)?shù)谌问褂?mL洗脫液再繼續(xù)洗脫時(shí)洗脫液中基本檢測不到目標(biāo)組分了。因此可見，按照1mL洗脫液進(jìn)行洗脫可以滿足回收率的要求，但如果使用兩個(gè)1mL即2mL進(jìn)行洗脫，則可以適當(dāng)提高實(shí)驗(yàn)回收率。

表4 L1-N3上機(jī)檢測結(jié)果 單位：μg/kg

樣品編號 環(huán)丙沙星 達(dá)氟沙星 恩諾沙星 沙拉沙星 理論值N1 0 0 0 0 0 N2 0 0 0 0 0 N3 0 0 0 0 0

4 結(jié)論

本文試驗(yàn)了不同的實(shí)驗(yàn)條件下，影響氟喹諾酮獸藥殘留檢測回收率的因素，經(jīng)過比較得出如下結(jié)論：

①流速過快會損失回收率。無論是上樣還是淋洗，盡量不要用洗耳球擠壓，應(yīng)當(dāng)讓過柱液體自然落下，如果流速過快，應(yīng)將萃取裝置的閥門進(jìn)行部分關(guān)閉，控制好流速是提升回收率的關(guān)鍵，這樣可以減少目標(biāo)組分由于流速過快造成的損失。

②加大洗脫液中有機(jī)溶劑的比例可以提高洗脫效率，提高回收率。對于檢測實(shí)踐中沙拉沙星回收率總是偏低的問題，可以通過調(diào)整洗脫液比例為磷酸/三乙胺和乙腈含量比70∶30進(jìn)行洗脫，可以顯著提高沙拉沙星的回收率。

③洗脫操作可以使用1mL洗脫，也可以使用2mL洗脫回收率均在合格范圍內(nèi)，但2mL洗脫，回收率更高。