基于網絡藥理學的鹽酸小檗堿治療抑郁癥作用機制研究▲

吳 進 王振輝 李 慧 肖 凱 王 芳 吳 佳

(湖南省婦幼保健院藥學研究部，長沙市 410008，電子郵箱：wuon4616@163.com)

抑郁癥是一種較為常見的精神障礙疾病，主要表現為情緒低落、焦慮、精力不集中、失眠等。中國現有抑郁癥患者超過9 500萬[1-2]，據世界衛生組織報告,抑郁已成為中國疾病負擔第二順位，預計2030年將上升至世界疾病負擔首位[3]，這將給社會帶來巨大的經濟壓力。但抑郁癥存在致病因素復雜、發病機制尚不清楚、臨床治愈率低等問題。有研究表明，鹽酸小檗堿單獨使用或者聯合抗抑郁藥物使用能夠改善患者的抑郁情況[4-5]；在臨床工作中筆者也發現，服用鹽酸小檗堿的患者，其抑郁癥狀得到相應的改善。但鹽酸小檗堿干預抑郁的作用機制還不甚明確。

網絡藥理學是一種基于系統生物學、多向藥理學、計算機虛擬運算及網絡數據庫檢索為一體的新型學科，其可以將某些藥物和相關疾病緊密聯系起來，建立“藥物-靶點-疾病”多層次的網絡結構，可幫助學者從系統和整體的角度預測和闡明藥物作用靶點及其潛在的作用機制，為藥物研究者提供新的思路和技術手段。故本研究從現代醫學的角度，運用網絡藥理學探討鹽酸小檗堿治療抑郁癥的作用機制，為進一步推廣鹽酸小檗堿的臨床應用提供參考依據。

1 資料與方法

1.1 鹽酸小檗堿靶點的篩選及蛋白質相互作用網絡構建 利用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP；http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php)檢索鹽酸小檗堿的作用靶點[6]；同時獲得鹽酸小檗堿化學結構的mol2格式文件，將mol2格式文件上傳至PharmMapper數據庫(http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/submitjob.html)進行靶點預測[7]并獲取前300個靶點(根據Maximum Generated Conformations排序篩選)的名稱等信息。通過Excel軟件對TCMSP數據庫和PharmMapper數據庫獲得的靶點進行合并、去重后，將靶點信息輸入UniProt數據庫(http://www.uniprot.org/)中進行檢索、校正，刪除不規范及重復靶點，得到小檗堿的作用靶點[8]。將小檗堿的作用靶點導入STRING數據庫(https://cn.string-db.org/)，選定物種為人，構建與靶點有相互作用的蛋白質相互作用(protein-protein interaction,PPI)網絡，以獲得更多鹽酸小檗堿的潛在作用靶點；導出小檗堿潛在作用靶點的PPI網絡文件，使用Cytoscape 3.5.1(http://www.cytoscape.org/)進行可視化分析[9]；然后對網絡的拓撲結構進行分析，以中介中心度(betweenness centrality,BC)、鄰近中心度(closeness centrality,CC)和度值(Degree)大于平均數為標準篩選鹽酸小檗堿的核心潛在作用靶點。

1.2 抑郁癥相關靶點的篩選 在GeneCards數據庫(https://www.genecards.org/)中，以“depression”“depressive” “antidepressant”為關鍵詞進行檢索[10]，獲得抑郁癥的相關靶點。

1.3 鹽酸小檗堿治療抑郁癥潛在靶點的確認及PPI網絡構建 利用Excel軟件對1.1獲得的小檗堿相關PPI網絡中的靶點與1.2獲得的疾病相關靶點，得到鹽酸小檗堿治療抑郁癥的潛在作用靶點，按照1.1的方法構建小檗堿治療抑郁癥的潛在作用靶點的PPI網絡，并對網絡的拓撲結構進行分析，以BC、CC、度值均大于平均值獲得小檗堿治療抑郁癥的核心潛在作用靶點。

1.4 鹽酸小檗堿治療抑郁癥潛在作用靶點的富集分析 利用生物信息學注釋數據庫DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)[11]對獲得的鹽酸小檗堿治療抑郁癥的潛在作用靶點進行基因本體論(Gene Ontology，GO)功能富集分析、京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析，采用Bonferroni法校正后，以P<0.01的項目為顯著富集[12-13]。

2 結 果

2.1 鹽酸小檗堿的作用靶點 TCMSP共檢索到鹽酸小檗堿靶點29個，將其與PharmMapper預測的300個鹽酸小檗堿靶點進行合并、去重，選定物種為人，共得到鹽酸小檗堿的潛在作用靶點218個。將這218個靶點導入STRING數據庫構建與其有相互作用的PPI網絡，從網絡中共獲得267個鹽酸小檗堿的潛在作用靶點，見圖1；運用Cytoscape軟件將PPI網絡進行可視化，對網絡的拓撲結構進行分析，結果顯示BC、CC和度值的平均值分別為0.010 5、0.334 8和8.29，且BC、 CC和度值均大于平均數的靶點共有42個(見表1)，即為鹽酸小檗堿的核心潛在作用靶點。

圖1 鹽酸小檗堿潛在作用靶點的PPI網絡

表1 鹽酸小檗堿的核心潛在作用靶點

2.2 鹽酸小檗堿治療抑郁癥的作用靶點 在GeneCards網站中共檢索到抑郁癥相關靶點14 271個，將其與267個鹽酸小檗堿的潛在作用靶點取交集后，得到184個鹽酸小檗堿治療抑郁癥的潛在作用靶點，見圖2。將這184個鹽酸小檗堿治療抑郁癥的潛在作用靶點導入STRING數據庫后，運用Cytoscape軟件構建可視化PPI網絡(見圖3)，對網絡的拓撲結構進行分析，結果顯示BC、 CC和度值的平均值分別為0.010 1、0.382 4和11.73；BC、 CC和度值均大于平均數的靶點共有35個，即為鹽酸小檗堿治療抑郁的核心潛在作用靶點(見表2)。根據網絡拓撲結構分析結果，在表1和表2中，BC、 CC和度值排名均位于前10的靶點共有7個，分別是白蛋白(albumin，ALB)、熱激蛋白90αA1(heat shock protein 90 alpha family class A member 1，HSP90αA1)、細胞色素C(cytochrome C,somatic，CYCS)、過氧化氫酶(catalase，CAT)、雌激素受體1(estrogen receptor 1，ESR1)、周期蛋白依賴性激酶2(cyclin-dependent kinase 2，CDK2)和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PD)。

圖2 鹽酸小檗堿治療抑郁癥潛在作用靶點的韋恩圖

圖3 鹽酸小檗堿治療抑郁癥潛在作用靶點的PPI網絡

表2 鹽酸小檗堿治療抑郁癥的核心潛在作用靶點

2.3 鹽酸小檗堿治療抑郁癥潛在作用靶點的富集分析 將得到的184個鹽酸小檗堿治療抑郁癥的潛在作用靶點進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。最終共得到184個GO生物學過程，其中G1/S有絲分裂細胞周期、對藥物的反應、對缺氧的反應、DNA復制、對雌二醇的反應、對雌激素的反應、凋亡過程的負調控、積極調控成纖維細胞增殖、積極調控細胞增殖、肽絲氨酸磷酸化、有絲分裂細胞周期檢查點、細胞分裂、氧氣運輸等24個生物學過程具有統計學意義(P<0.01)，見表3。鹽酸小檗堿治療抑郁癥的潛在作用靶點涉及的KEGG富集通路共45個，其中細胞周期、p53信號通路、叉頭框蛋白O(forkhead box O,FoxO)信號通路、催乳素信號通路、抗生素的生物合成、精氨酸生物合成、氨基酸的生物合成、精氨酸和脯氨酸代謝等18個KEGG信號通路具有統計學意義(P<0.01)，見表4。

表3 鹽酸小檗堿治療抑郁癥潛在作用靶點的GO功能富集分析結果

表4 鹽酸小檗堿治療抑郁癥潛在作用靶點的KEGG富集分析結果

3 討 論

已有學者報告，鹽酸小檗堿能夠改善腸易激綜合征患者的焦慮癥狀[3]；對于既往經三環類抗抑郁藥及5-羥色胺和去甲腎上腺素再攝取抑制劑系統治療但癥狀改善不理想的重度抑郁障礙患者，聯合小檗堿治療后，抑郁癥狀和軀體疼痛相關癥狀可獲得顯著改善[14]；鹽酸小檗堿聯合艾司西酞普蘭能夠改善老年抑郁癥患者的睡眠障礙，并顯著降低漢密爾頓抑郁量表評分[4]。在動物實驗中，不同學者均發現鹽酸小檗堿能夠改善小鼠的抑郁樣行為[15-17]，說明小檗堿有一定的抗抑郁作用[18]。

我們將鹽酸小檗堿的潛在作用靶點與抑郁癥相關靶點進行對比并取交集，得到鹽酸小檗堿治療抑郁癥的潛在作用靶點共184個。利用STRING數據庫構建PPI網絡，通過Cytoscape軟件進行分析后發現，ALB、HSP90αA1、CYCS、ESR1、CDK2等靶點較為重要。徐靜等[19]研究發現，抑郁癥患者體內血清ALB水平與漢密爾頓抑郁量表評分呈負相關，其機制可能與抑郁癥患者體內普遍存在炎癥相關因子，并伴有炎癥反應激活，而炎癥相關因子可促使胰島素樣生長因子1大量分解，進而抑制肝臟蛋白合成有關[20]。韋玨伶等[21]發現中重度抑郁組肝癌患者HSP90αA1/HSPA8的表達顯著高于無抑郁組和輕度抑郁組，提示HSP90αA1與抑郁存在密切聯系。孔令韜等[22]的動物實驗結果表明，慢性應激抑郁模型大鼠海馬組織中CYCS的表達水平降低，抗抑郁藥物氟西汀和噻奈普汀可能通過抑制神經元內線粒體釋放CYCS，達到減少應激導致的神經元凋亡，從而起到治療抑郁的作用。CDK2的作用不僅局限于調控細胞周期，而且能夠參與對神經細胞凋亡的調控，從而影響抑郁癥狀[23]。有學者發現ESR1基因多態性與女性圍絕經期抑郁癥狀存在關聯，而其與5-羥色胺基因多態交互作用可能增加女性圍絕經期抑郁的風險[24-25]。

我們將184個鹽酸小檗堿治療抑郁的潛在作用靶點導入DAVID數據庫，進行GO生物學功能分析，結果顯示，這些靶點參與細胞增殖分化、細胞凋亡、對細胞周期的調節，以及多種蛋白、氨基酸、脂質代謝和缺氧的調控。對184個靶點進行KEGG通路富集分析，結果顯示，這些靶點能夠對細胞周期、p53信號通路、FoxO信號通路、多種營養物質的合成等進行調節。以上結果提示鹽酸小檗堿可通過多層次、多途徑發揮治療抑郁癥的作用。

有研究結果表明，抑郁癥的病因與應激引起的神經元細胞的萎縮和死亡有關[26-27]。 p53是細胞應激反應的關鍵調節因子， p53信號通路的激活可誘導神經元凋亡，這可能是導致抑郁癥發生和發展的原因之一[28]。也有研究顯示，DNA的表觀遺傳學修飾在抑郁癥的發生和發展中發揮重要作用[29-30]。以上均表明，抑郁癥的發生與細胞增殖、凋亡、細胞周期有著密切聯系。并且多種抗抑郁藥物能夠通過調控細胞周期、抑制細胞凋亡、促進神經細胞增殖，從而發揮神經保護作用，起到治療抑郁的效果[26，31-32]。而我們通過網絡藥理學的研究發現，鹽酸小檗堿也能影響細胞周期、凋亡、增殖等多個過程，并可參與p53信號通路的調控。

近年有研究表明，大腦中氧化應激水平的升高和能量代謝的異常在抑郁癥的發病機制中起著重要作用[33-36]。缺氧誘導因子1可調節糖代謝、能量代謝、血管新生、炎癥因子等相關基因的表達，以應對組織中氧含量的降低或缺氧[37]。缺氧誘導因子1還可通過介導線粒體代謝來減輕氧化應激，從而發揮抗缺氧作用[38]。因此，間歇性低氧適應和高壓氧治療被認為是治療抑郁癥的新的補充療法[39]。而在本研究中，我們也發現，鹽酸小檗堿能夠調節對缺氧的反應，說明其可能會通過對缺氧的調節，發揮治療抑郁癥的作用。

FoxO在細胞生理和生物學中發揮著重要作用。有研究結果表明，FoxO參與了嚴重抑郁障礙的發生：FoxO上游分子的改變，如腦源性神經營養因子或蛋白激酶B被認為與抑郁癥有關[40]；此外，FoxO可能受5-羥色胺和去甲腎上腺素受體信號及下丘腦-垂體-腎上腺軸的調節，而FoxO可調節神經元形態、突觸發生和成年海馬神經發生[41]；黃英杰等[42]已經證實FoxO 1抑制劑AS1842856能夠逆轉高脂飲食引起的小鼠抑郁樣行為。而本研究中，我們發現鹽酸小檗堿可能通過調節FoxO信號通路，發揮治療抑郁癥的作用。

綜上所述，鹽酸小檗堿可能通過p53信號通路、FoxO信號通路、調控缺氧等多種途徑發揮治療抑郁癥的作用，其中有部分靶點和作用機制已有文獻證實，在一定程度上證明了本研究的可靠性，其余作用靶點和作用機制尚需進一步探索和證實。