原兒茶酸對脂多糖誘導的人牙周膜成纖維細胞炎癥反應的保護作用及機制▲

馬 濤 時 婧 張 蕾 沈鵬鵬

(1 新疆烏魯木齊市口腔醫院藥劑科,烏魯木齊市 830002，電子郵箱：kraa9673@163.com； 2 新疆醫科大學第五附屬醫院老年病科，烏魯木齊市 830011； 3 新疆醫科大學基礎醫學院，烏魯木齊市 830011)

牙周炎是一種由菌斑微生物感染引起的慢性炎癥性疾病，隨著疾病的進展，最終可導致牙周結締組織和牙槽骨的破壞[1]。研究表明，牙周炎可能是糖尿病、動脈粥樣硬化性心血管疾病、嬰兒出生低體重、代謝綜合征、慢性腎功能衰竭、類風濕性關節炎和神經退行性疾病的危險因素[2]。因此，探討更有效的牙周炎治療策略對于改善人類疾病現狀具有重要意義。最近的研究表明，脂多糖可誘導人牙周膜成纖維細胞(human periodontal ligament fibroblast，HPDLF)中NOD樣受體蛋白3(NOD-like receptor protein 3，NLRP3)炎癥小體活化，促進白細胞介素(interleukin，IL)-1β的分泌[3]。此外，NLRP3炎癥小體受多種上游信號的調控，包括沉默信息調節因子1(sirtuin 1，SIRT1)的負調控和硫氧還蛋白相互作用蛋白(thioredoxin-interacting protein，TXNIP)的正調控[4-5]。原兒茶酸是一種酚類化合物，是花青素的主要代謝物，存在于多種水果、蔬菜和易腐爛的植物，如橄欖、白葡萄和玫瑰茄。它具有多種有益的生物學效應，包括抗炎、抗氧化和抗凋亡作用[6]。已有研究表明，原兒茶酸可通過調控SIRT1/核因子κB (nuclear factor κB,NF-κB)途徑抑制脂多糖誘導的小膠質細胞炎癥介質的釋放[7]。但原兒茶酸是否可以改善牙周炎，其相關機制如何，目前尚未清楚。本研究采用脂多糖誘導建立HPDLF炎癥模型，探究原兒茶酸對炎癥性HPDLF的保護作用及其機制，以期為開發治療牙周炎的新藥物提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料 HPDLF購自武漢普諾賽公司；脂多糖(美國Sigma公司，批號：L2880)；原兒茶酸(質量標準：高效液相色譜純度≥98%;大連美侖生物技術有限公司，貨號：MB7050)；活性氧簇檢測試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，批號：100T)；IL-1β和IL-18檢測試劑盒(上海紀寧實業，批號：20200318)；細胞計數檢測(cell counting kit-8， CCK-8)試劑盒(日本同仁，批號：202)；Lipofectamine 2000轉染試劑(美國賽默飛世爾，批號：11668)；NLRP3(武漢三鷹，批號：22006)、TXNIP(武漢三鷹，批號：66005)、激活型天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶1(cysteinyl aspartate specific proteinase 1，Caspase1;英國Abcam公司，批號：P42574)、SIRT1(武漢三鷹，批號：33002)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH；武漢三鷹，批號：33004)抗體；SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ 試劑盒(日本TaKaRa公司，批號：DRR041A)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養：HPDLF用含10%胎牛血清的杜氏改良伊格爾培養基(Dulbecco′s modified Eagle medium，DMEM;賽默飛世爾公司，批號：A4192101)，于37℃、5% CO2細胞培養箱中培養。待細胞密度達到80%～90%時，用0.25%胰酶液消化細胞，進行后續實驗。

1.2.2 原兒茶酸給藥濃度的篩選：將對數生長期的HPDLF接種于96孔板，接種密度為5×103個/孔，于37℃、5% CO2細胞培養箱中培養12 h后，添加相應濃度原兒茶酸(0 μmol/L、1.25 μmol/L、2.50 μmol/L、5.00 μmol/L、10.00 μmol/L、20.00 μmol/L、40.00 μmol/L、80.00 μmol/L和160.00 μmol/L)，繼續培養24 h后，向各組細胞中加入CCK-8試劑，10 μL/孔，37℃條件下孵育3 h。采用酶標儀測定各孔在450 nm波長處的光密度(optical density,OD)值。細胞活力=給藥組OD450 nm/0 μmol/L原兒茶酸組OD450 nm×100%。

1.2.3 細胞分組與干預：(1)原兒茶酸對脂多糖誘導的HPDLF炎癥反應的影響。取對數生長期的HPDLF接種于96孔板，接種密度為5×103個/孔，于37℃、5% CO2培養箱中繼續培養12 h后，將細胞分為空白對照組、脂多糖組、脂多糖+5.00 μmol/L原兒茶酸組和脂多糖+10.00 μmol/L原兒茶酸組。除空白對照組外，其他3組均加入脂多糖(10 μg/mL)[8]及不同濃度的原兒茶酸(0 μmol/L、5.00 μmol/L、10.00 μmol/L),在37℃、5% CO2培養箱中繼續培養24 h。空白對照組加磷酸緩沖鹽溶液，每組設置3個復孔。(2)敲低SIRT1后原兒茶酸對脂多糖誘導的HPDLF的影響。①取對數生長期的HPDLF按4×105個/孔接種于6孔板，于37℃、5% CO2培養箱中培養12 h后，將細胞分為空白對照組、si-NC組、si- SIRT1組，按Lipofectamine 2000轉染試劑的說明書將si-NC和si- SIRT1轉染至HPDLF，空白對照組只加入Lipofectamine 2000轉染試劑，37℃、5%CO2條件下培養48 h后，觀察轉染效果，轉染率達到80%后對各組細胞進行藥物干預。②取對數生長期的HPDLF按4×105個/孔接種于6孔板，于37℃、5% CO2培養箱中培養12 h后，將細胞分為si-NC組、脂多糖+si-NC組、脂多糖+原兒茶酸+si-NC組、脂多糖+原兒茶酸+si-SIRT1組。按上述方法轉染細胞后，除si-NC組外，其他3組均加入脂多糖(10 μg/mL)，在此基礎上，脂多糖+原兒茶酸+si-NC組、脂多糖+原兒茶酸+si- SIRT1組同時加入原兒茶酸(10 μmol/L)。藥物處理細胞24 h后檢測指標，實驗重復3次。

1.2.4 CCK-8法檢測細胞增殖：按1.2.3方法處理細胞24 h后，向各組細胞中加入CCK-8試劑，10 μL/孔，37℃條件下孵育3 h。采用酶標儀測定各孔在450 nm波長處的OD值。細胞活力=實驗組OD450 nm/空白對照組OD450 nm×100%。

1.2.5 流式細胞術檢測細胞活性氧簇水平：按1.2.3方法處理細胞后，按照活性氧簇檢測試劑盒說明書，分別向各組HPDLF中加入10 μmol/L的活性氧簇熒光探針并使其完全覆蓋細胞，37℃條件下孵育30 min，磷酸緩沖鹽溶液洗滌細胞3次，3～5 min/次。0.25%胰酶液消化細胞，磷酸緩沖鹽溶液洗滌細胞2～3次，3～5 min/次，重懸細胞，使用流式細胞儀檢測細胞活性氧簇水平。

1.2.6 蛋白質印跡法檢測細胞NLRP3、TXNIP、激活型Caspase1和SIRT1蛋白表達：按1.2.3方法處理細胞后，收集各組HPDLF，RIPA裂解液裂解細胞，4℃下12 000 r/min離心5 min后取上清，二喹啉甲酸法測定蛋白濃度。取30 μg蛋白上樣進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白并將其轉至聚偏氟乙烯膜上。10%脫脂奶粉于室溫搖床上封閉2 h，加入NLRP3(1 ∶3 000)、TXNIP(1 ∶5 000)、激活型Caspase1(1 ∶1 000)、SIRT1(1 ∶3 000)和GAPDH(1 ∶5 000)抗體，4℃條件下孵育過夜，加入二抗(1 ∶5 000)室溫孵育1 h后，滴加BeyoECL Star工作液到膜上，采用化學發光成像儀(廠家：美國Alpha公司;型號：FluorChem FC3)檢測蛋白表達水平。以目的蛋白條帶灰度值與內參蛋白條帶灰度值比值為目的蛋白相對表達水平。

1.2.7 酶聯免疫吸附測定法檢測細胞IL-1β和IL-18含量：按1.2.3方法處理細胞后，收集各組HPDLF，1 000 r/min離心5 min，取上清液。根據酶聯免疫吸附測定試劑盒說明書，檢測上清液中IL-1β和IL-18的水平。

1.2.8 實時熒光定量PCR檢測SIRT1 mRNA相對表達水平：按1.2.3方法處理細胞后，收集各組HPDLF，采用TRIzol法提取細胞總RNA，測定RNA濃度，按照SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒說明書將RNA反轉錄合成cDNA。以cDNA為模板，以GAPDH為內參，采用實時熒光定量PCR對cDNA進行擴增，反應條件為95℃、30 s；95℃、5 s，60℃、34 s，40個循環。SIRT1上游引物為5′-TGCTGGCCTAATAGAGTGGCA-3′， 下游引物為5′-CTCAGCGCCATGGAAAATGT-3′； GAPDH上游引物為5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′， 下游引物為5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′。采用2-ΔΔCt法計算SIRT1 mRNA相對表達水平。

1.3 統計學分析 采用SPSS 21.0軟件進行統計分析，計量資料以(x±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 原兒茶酸對脂多糖誘導的HPDLF活力的影響 與0 μmol/L組相比，20.00 μmol/L組、40.00 μmol/L組、80.00 μmol/L組和160.00 μmol/L組細胞活力顯著降低(均P<0.05)，見表1。這提示劑量≥20.00 μmol/L時原兒茶酸已對細胞產生毒性，0 μmol/L、1.25 μmol/L和2.50 μmol/L組可能由于劑量過小未對細胞活力產生影響，因此，本研究選擇5.00 μmol/L和10.00 μmol/L濃度原兒茶酸進行后續實驗。與空白對照組相比，脂多糖+5.00μmol/L原兒茶酸組和脂多糖+10.00 μmol/L原兒茶酸組細胞活力降低(均P<0.05)，但脂多糖組的細胞活力與空白對照組差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

表1 不同原兒茶酸給藥濃度下HPDLF的活力(x±s，%)

表2 原兒茶酸對脂多糖誘導的HPDLF活力的影響(x±s，%)

2.2 原兒茶酸對脂多糖誘導的HPDLF活性氧簇水平的影響 與空白對照組相比，其他3組細胞活性氧簇水平升高(均P<0.05)；與脂多糖組相比，脂多糖+5.00 μmol/L原兒茶酸組和脂多糖+10.00 μmol/L原兒茶酸組細胞活性氧簇水平降低(均P<0.05)。見圖1及表3。

圖1 原兒茶酸對脂多糖誘導的HPDLF活性氧簇水平的影響

表3 原兒茶酸對脂多糖誘導的HPDLF活性氧簇水平的影響(x±s)

2.3 原兒茶酸對脂多糖誘導的HPDLF的TXNIP-NLRP3軸的影響 與空白對照組相比，脂多糖組細胞TXNIP、NLRP3和激活型Caspase1蛋白表達水平升高(均P<0.05)；與脂多糖組相比，脂多糖+5.00 μmol/L原兒茶酸組和脂多糖+10 μmol/L原兒茶酸組細胞TXNIP和激活型Caspase1蛋白表達水平降低,且脂多糖+10 μmol/L原兒茶酸組細胞NLRP3蛋白表達水平低于脂多糖組(均P<0.05)。見圖2和表4。

圖2 各組細胞TXNIP、NLRP3和激活型Caspase1蛋白的表達情況

表4 原兒茶酸對脂多糖誘導的HPDLF中TXNIP、NLRP3和激活型Caspase1蛋白表達的影響(x±s)

2.4 原兒茶酸對脂多糖誘導的HPDLF的IL-1β和IL-18水平的影響 與空白對照組相比，脂多糖組細胞IL-1β和IL-18水平升高(均P<0.05)；與脂多糖組相比，脂多糖+5.00 μmol/L原兒茶酸組和脂多糖+10.00 μmol/L原兒茶酸組細胞IL-1β和IL-18水平降低(均P<0.05)。見表5。

表5 原兒茶酸對脂多糖誘導的HPDLF的IL-1β和IL-18水平的影響(x±s，pg/mL)

2.5 原兒茶酸對脂多糖誘導的HPDLF的SIRT1表達水平的影響 與空白對照組相比，脂多糖組細胞SIRT1 mRNA和蛋白表達水平降低(均P<0.05)；與脂多糖組相比，脂多糖+5.00 μmol/L原兒茶酸組和脂多糖+10.00 μmol/L原兒茶酸組細胞SIRT1 mRNA和蛋白表達水平升高(均P<0.05)。見圖3和表6。

圖3 各組HPDLF細胞SIRT1蛋白表達的情況

表6 原兒茶酸對脂多糖誘導的HPDLF的SIRT1表達水平的影響(x±s)

2.6 敲低SIRT1逆轉原兒茶酸對脂多糖誘導的HPDLF的TXNIP-NLRP3軸的抑制作用 si-SIRT1干擾效率檢測結果顯示，與si-NC組相比，si-SIRT1組細胞SIRT1 mRNA和蛋白表達水平降低(均P<0.05)，見圖4和表7，提示采用 si-SIRT1干擾細胞成功。與si-NC組相比，脂多糖+si-NC組細胞SIRT1蛋白表達水平降低，TXNIP和NLRP3蛋白表達水平升高(均P<0.05)；與脂多糖+si-NC組相比，脂多糖+原兒茶酸+si-NC組細胞SIRT1蛋白表達升高，TXNIP和NLRP3蛋白表達水平降低(均P<0.05)；與脂多糖+原兒茶酸+si-NC組相比，脂多糖+原兒茶酸+si-SIRT1組細胞SIRT1蛋白表達水平降低，TXNIP和NLRP3蛋白表達水平升高(均P<0.05)。見圖5和表8。

圖4 si-SIRT1干擾效率檢測結果

表7 si-SIRT1干擾效率檢測結果(x±s)

圖5 敲低SIRT1后各組細胞SIRT1、TXNIP、NLRP3蛋白表達的情況

表8 敲低SIRT1逆轉原兒茶酸對TXNIP-NLRP3軸的抑制作用(x±s)

2.7 敲低SIRT1后原兒茶酸對脂多糖誘導的HPDLF活性氧簇、IL-1β和IL-18水平的影響 與si-NC組相比，脂多糖+si-NC組細胞活性氧簇、IL-1β和IL-18水平升高(均P<0.05)；與脂多糖+si-NC組相比，脂多糖+原兒茶酸+si-NC組細胞活性氧簇、IL-1β和IL-18水平降低(均P<0.05)；與脂多糖+原兒茶酸+si-NC組相比，脂多糖+原兒茶酸+si-SIRT1組細胞活性氧簇、IL-1β和IL-18水平升高(均P<0.05)。見圖6和表9。

圖6 敲低SIRT1后原兒茶酸對脂多糖誘導的HPDLF活性氧簇水平的影響

表9 敲低SIRT1后原兒茶酸對脂多糖誘導的HPDLF 活性氧簇、IL-1β和IL-18水平的影響(x±s)

3 討 論

牙周炎是一種牙周組織(包括牙齦、牙周膜、牙槽骨和牙骨質)的炎癥性疾病，最終可導致牙齒脫落[9]。牙周膜是位于下頜骨牙骨質和牙槽骨之間的一種結締組織，其在維持牙周組織的完整性和促進組織再生中起著關鍵作用[10]。牙周膜成纖維細胞(periodontal ligament fibroblast，PDLF)是牙周膜中最常見的細胞，在維持組織完整性方面具有明顯的功能活性。此外， PDLF還參與牙周病的免疫和炎癥反應[11]。原兒茶酸因具有潛在的神經保護作用，并作為治療神經退行性疾病的藥物而受到廣泛關注。研究表明，原兒茶酸可減少阿爾茨海默病、帕金森病、腦缺血和創傷性腦損傷等神經退行性疾病動物模型中的神經毒性和神經元細胞死亡[12]。而關于原兒茶酸在牙周炎中的作用還尚未可知，本研究旨在探究原兒茶酸在牙周炎中的作用及其機制。

牙齦卟啉單胞菌是最常見的牙周病原菌。牙齦卟啉單胞菌脂多糖通過激活NF-κB途徑，促進炎癥介質的釋放，引起牙周膜炎癥反應[13]。眾所周知，炎性小體作為細胞內的傳感器，對各種病原體相關和損傷相關的分子模式起著重要的作用[14]。已有研究表明，NLRP3炎性小體及其下游因子IL-1β和IL-18在牙周病進展中發揮重要作用[15]。本研究結果顯示，與空白對照組相比，脂多糖組細胞NLRP3蛋白表達水平IL-1β和IL-18水平升高(均P<0.05)，提示脂多糖可誘導HPDLF中NLRP3炎性小體活化，并促進IL-1β和IL-18的釋放；與脂多糖組相比，脂多糖+5.00 μmol/L原兒茶酸組和脂多糖+10.00 μmol/L原兒茶酸組細胞IL-1β和IL-18水平降低(均P<0.05)，脂多糖+10.00 μmol/L原兒茶酸組細胞NLRP3蛋白表達水平低于脂多糖組(均P<0.05)，提示采用原兒茶酸處理可抑制脂多糖誘導的HPDLF的NLRP3炎性小體活化，抑制IL-1β和IL-18的產生。

研究表明，活性氧簇作用于NLRP3炎癥小體上游相關因子，引起炎性小體的活化，高濃度葡萄糖和脂多糖以活性氧簇敏感的方式促進腎小球系膜細胞中TXNIP和NLRP3的表達，從而促進炎癥的發生[16]。另有研究表明，抑制活性氧簇/TXNIP/NLRP3炎癥信號，可逆轉高血糖對視網膜Müller細胞增殖和促血管生成因子生成的促進作用[17]。由此可見，活性氧簇/TXNIP/NLRP3炎癥信號在不同疾病中均發揮著重要的作用。本研究結果顯示，與空白對照組相比，脂多糖組細胞活性氧簇水平、TXNIP蛋白表達水平升高(均P<0.05)，提示脂多糖可促進HPDLF中活性氧簇的產生和TXNIP的表達，而與脂多糖組相比，脂多糖+5.00 μmol/L原兒茶酸組和脂多糖+10.00 μmol/L原兒茶酸組細胞活性氧簇水平、TXNIP蛋白表達水平降低(均P<0.05)，提示原兒茶酸可抑制脂多糖誘導的HPDLF活性氧簇的產生和TXNIP的表達，其可能通過抑制活性氧簇的產生，從而抑制TXNIP-NLRP3軸介導的炎癥反應。

SIRT1在抑制細胞炎癥中起重要作用。研究表明，SIRT1過表達可抑制脂多糖和腺嘌呤核苷三磷酸聯合誘導人臍靜脈血管內皮細胞中NLRP3炎性小體的活化以及激活型Caspase1的表達和IL-1β的分泌，而敲除SIRT1則促進NLRP3的活化[18]。另有研究表明，敲低SIRT1可逆轉粉防己堿抑制NLRP3炎性小體活化，以及IL-1β和IL-18表達的作用，減弱粉防己堿對腦缺血再灌注小鼠的保護作用[19]。此外，姜黃素可通過上調SIRT1的表達，抑制活性氧簇和腫瘤壞死因子α的產生，以劑量依賴的方式減輕失血性休克和輸血復蘇所致的肺屏障功能損害[20]。以上研究表明，SIRT1通過抑制活性氧簇的產生和NLRP3炎性小體的活化，在不同疾病中發揮保護作用。本研究結果顯示，與空白對照組相比，脂多糖組細胞SIRT1 mRNA和蛋白表達水平降低(均P<0.05)；與脂多糖組相比，脂多糖+5.00 μmol/L原兒茶酸組和脂多糖+10.00 μmol/L原兒茶酸組細胞SIRT1 mRNA和蛋白表達水平升高(均P<0.05)。這提示脂多糖可抑制HPDLF中SIRT1的表達，而原兒茶酸可逆轉該作用。此外，本研究還發現，與脂多糖+原兒茶酸+si-NC組相比，脂多糖+原兒茶酸+si-SIRT1組細胞活性氧簇IL-1β和IL-18水平升高(均P<0.05)，提示敲低SIRT1后，原兒茶酸逆轉脂多糖誘導HPDLF炎癥反應的作用減弱，提示SIRT1可能參與原兒茶酸對HPDLF炎癥反應的保護作用。

綜上所述，原兒茶酸可能通過上調SIRT1的表達，抑制脂多糖誘導的HPDLF中TXNIP-NLRP3軸的活化，減輕細胞炎癥反應。這為明確原兒茶酸在牙周炎中的作用機制及開發治療牙周炎的新藥物提供新的依據。