水通道蛋白1與非小細胞肺癌的相關性研究

馬亞文，Bingling Xu，劉麗華

（1.廣西醫科大學第一附屬醫院呼吸內科，廣西 南寧 530021；2.Royal Brompton Hospital，England London SW3 6LY）

肺癌（lung cancer）是最常見的惡性腫瘤之一，具有高發病率和高死亡率，是全球死亡率最高的癌癥之一，肺癌的5年生存率僅為19%[1]。手術、放療、化療和靶向治療是目前非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）的主要治療方式，然而晚期NSCLC的生存率仍較低，患者中位生存期僅為10～12 個月[2，3]。肺癌細胞對化療藥物顯著的耐藥性是晚期癌癥進展的主要原因，目前急需探索新的治療方案，提高肺癌患者的生存期。AQP1 是存在于細胞膜上的水通道蛋白（aquaporins，AQPs）家族中成員，主要促進水的跨細胞轉運，并在細胞生命活動和細胞凋亡中發揮重要作用[4]。研究發現[5-8]，AQP1 在乳腺癌、胃癌、前列腺癌、結腸癌等都過度表達，并且已被證明是結腸癌患者預后較差的標志物，但其在肺癌中的作用尚未完全明確。基于此，本研究旨在探討AQP1 在NSCLC 患者胸膜中的表達情況及對非小細胞肺癌A549 細胞凋亡、增殖功能的影響，以期為NSCLC的治療提供新的策略。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集廣西醫科大學第一附屬醫院2020年5月-2021年10月60 例內科胸腔鏡下手術患者的胸膜組織進行石蠟包埋切片，其中非小細胞肺癌胸膜組織標本40 例，良性胸腔胸膜組織標本20 例，患者年齡19～80 歲。納入標準：患者臨床資料完整。排除標準：合并嚴重心腦肝腎疾病者。

1.2 主要試劑及儀器 A549 細胞及專用培養基（武漢普諾賽生命科技有限公司CM-0016）、AQP1 慢病毒及陰性對照病毒（上海吉凱基因公司）、CCK-8 試劑盒（meilunbio，大連美侖生物公司）、AQP1 抗體（美國Thermo Fisher Scientific 公司，MA5-25401）、AQP1 抑制劑BacopasideⅡ（上海MCE 公司，HYN6016）、胰蛋白酶消化液（0.25%）不含EDTA（索萊寶科技公司）、凋亡試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技有限公司）、多功能酶標儀（美國雷杜Rayto RT-6100）、流式細胞儀（中國達科為生物公司）、DAB 顯色試劑盒（武漢塞維爾生物科技有限公司，G1211）。

1.3 免疫組化實驗 采用S-P 法對患者標本AQP1表達情況進行測定，用4%的甲醛將收集的標本進行固定，石蠟包埋后進行連續切片，并放入恒溫烤箱烤片，采用常規的操作對切片進行脫蠟水化后，用PBS 溶液清洗，并用pH6.0的檸檬酸鈉鹽緩沖液對抗原進行高壓修復。然后將以下試劑依次進行滴加，具體操作如下：內源性過氧化物酶溶液、封閉用非免疫動物血清、一抗孵育過夜、二抗孵育20 min、辣根酶標記鏈霉卵白工作液孵育10 min、滴加DAB 顯色試劑（新鮮配置）顯色2 min、并在顯微鏡下進行染色觀察、自來水沖洗、蘇木素進行復染、1%鹽酸酒精分化2 s、自來水沖洗、脫水和透明處理、中性樹膠封片。

1.4 培養細胞及病毒轉染 將培養的A549 細胞分別轉染AQP1（NM_198098）慢病毒和陰性對照病毒，轉染成功后，分別用含有嘌呤霉素的培養基進行篩選穩定株，熒光顯微鏡下觀察表達效果。

1.5 細胞增殖實驗 將對照組（正常細胞）、轉染過表達AQP1 及陰性對照病毒的穩定株進行培養，待匯合度達80%時，胰酶消化后利用完全培養基重懸細胞，進行細胞計數，取相同數量的細胞接種到96 孔板中，每孔加100 μl 細胞懸液，各設置3 個重復孔，37 ℃培養箱內培養24 h，吸棄原培養基，加入100 μl含有10% CCK-8 增強型溶液的培養基，培養箱內培養0.5 h，用酶標儀測定在450 nm 處的吸光度。

1.6 細胞凋亡流式細胞術檢測 收集對照組和抑制劑組（加入AQP1 抑制劑BacopasideⅡ）的細胞，用0.25%EDTA-Free 溶液消化細胞，并收集至1.5 ml離心管中，1000 r/min 離心5 min，吸棄上清液，保留少量液體覆蓋細胞沉淀。用預冷磷酸鹽緩沖液（PBS）洗2 次，加入Annexin V-AF488 染料2.5 μl，避光染色15 min，加入400 μl Bindingbuffer，混勻后置于流式細胞儀中檢測細胞凋亡情況。

1.7 結果判定 AQP1 陽性結果判斷：AQP1 蛋白在腫瘤組織中主要表達在細胞膜及細胞胞漿中。根據陽性細胞密度和著色深度進行評分，結果判斷標準：①根據陽性細胞密度評定：無陽性細胞數計為0分，陽性細胞所占比例≤10%為1 分，11%～50%為2分，51%～75%為3 分，≥76%為4 分；②根據染色程度進行評分：強棕褐色評為3 分，棕黃色評為2 分，淡黃色評為1 分，無色評為0 分；兩項評分的乘積＜1 分為陰性，≥1 分為陽性表達，＜4 分為蛋白低表達，≥4 分為蛋白高表達。

1.8 統計學分析 統計分析及作圖軟件均使用GraphPad Prism 8.0.1 進行，計量資料采用（±s）表示，組間比較采用方差分析（one-way ANOVA）；計數資料采用[n（%）]表示，采用x2檢驗或Fisher 精確檢驗；P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 AQP1 在胸膜組織的表達比較 免疫組化分析顯示，良性胸膜組織標本中AQP1 表達較少，非小細胞肺癌胸膜組織標本中AQP1 表達呈強陽性，見圖1。且在非小細胞肺癌胸膜組中AQP1 陽性率為80%，良性胸膜組織中AQP1 陽性率為25%。

2.2 獲得病毒表達穩定株 通過含有嘌呤霉素的培養基篩選，可獲得穩定轉染株，熒光顯微鏡下能檢測到綠色熒光，見圖2。

2.3 過表達AQP1 促進A549 細胞增殖 相同的培養條件下過表達AQP1，結果可見過表達AQP1 能夠促進A549 增殖，見圖3。

圖3 AQP1 對A549 細胞增殖的作用

2.4 抑制AQP1 表達促進A549 細胞凋亡 與對照組相比，抑制劑組在抑制AQP1 表達后促進了A549細胞早期和晚期的凋亡，對照組和抑制組早期凋亡率分別為0.96%、1.76%，晚期凋亡率分別為0.41%、0.52%，見圖4。

圖4 AQP1 抑制劑對A549 細胞凋亡的影響

3 討論

肺癌是癌癥死亡的首要原因，NSCLC 約占肺癌總發病率的85%，其發病原因與吸煙、環境污染、呼吸道疾病等密切相關[9，10]。NSCLC 發病較為隱匿，患者確診時大多已處于中晚期狀態，只能通過化療、放療等方式延緩其生存期，其預后較差且病死率較高[11]。因此，探索NSCLC的進展機制對改善肺癌患者的預后有重要作用。

AQPS 廣泛存在于人體組織中，是水快速跨膜轉運的重要物質基礎，在細胞新陳代謝、增殖和各種器官生理功能中發揮重要作用[7，12]。AQP1 是存在于細胞膜上水通道蛋白家族中的一員，主要促進水的跨細胞轉運，廣泛分布于內皮、上皮和特殊細胞中，如紅細胞、骨骼肌細胞等，參與多種病理和生理過程[13，14]。AQP1 已在多種腫瘤中被證實可通過促進腫瘤細胞的侵襲、遷移、血管生成在腫瘤的發生發展中發揮重要作用[15-17]。另外，AQP1 對腫瘤患者的預后具有一定影響，如研究發現AQP1 與胰腺導管癌的不良預后相關，在動物研究實驗中敲低AQP1可以抑制骨肉瘤細胞的增殖、侵襲和腫瘤的發生發展[18，19]。已有研究發現[4，20]，AQP1 是肺腺癌獨立的預后標志，并可能通過細胞間充質轉化作用增加腫瘤細胞的侵襲性。

本研究結果顯示，過表達AQP1 可以增強A549細胞的增殖能力，抑制AQP1的表達則促進了A549細胞早期和晚期的凋亡，且與良性胸膜組織相比，NSCLC 患者胸膜組織中AQP1 呈高表達。據此，推測在NSCLC 中AQP1 可能通過抑制細胞的凋亡從而促進了癌細胞的增殖能力。因此，AQP1 可做為癌癥治療的一個新靶點，可通過降低其在癌細胞中的表達水平來干預腫瘤的進展。此外，已有研究表明AQP1 參與腫瘤轉移過程[21]。而本研究收集的NSCLC組織標本均已發生胸膜轉移，因此猜測AQP1 可能與NSCLC的胸膜轉移有密切關系，但AQP1 與胸膜轉移的具體機制尚未完全闡明，未來還需要進一步研究。

綜上所述，非小細胞肺癌患者的胸膜組織中AQP1 表達水平高于良性胸膜組織，且在外源性AQP1 刺激作用下能夠促進A549 細胞增殖，抑制AQP1的表達可促進A549 細胞的凋亡。但AQP1 通過調節細胞增殖和凋亡影響NSCLC 進展的具體信號通路及分子機制仍不清楚，其中，促進細胞凋亡可能是抑制癌細胞增殖的關鍵。