藏藥檀香清咽片對慢性支氣管炎模型大鼠支氣管肺MyD88/NF-κB/ICAM-1信號通路的影響

邵國強，杜 青，李躍輝，達瓦桑珠，扎西次仁

(1. 湖南省中醫藥研究院，湖南 長沙 410006；2. 西藏自治區山南市藏醫醫院，西藏 山南 856000)

慢性支氣管炎(chronic bronchitis，CB)是臨床上常見的以慢性咳嗽咳痰、伴隨喘息為主要特征的呼吸系統疾病，可能通過環境暴露、遺傳易感性或大量接觸有害顆粒或氣體(例如香煙煙霧)激活，具有高發性、易感性等[1]。CB的進展與氣管、支氣管黏膜和周圍組織的慢性非特異性炎癥有關，長時間可導致一系列支氣管肺組織結構功能改變和代謝異常，嚴重者甚至引起阻塞性肺氣腫、肺源性心血管疾病、肺癌等[2]。CB的治療常采用吸氧、抗生素、祛痰藥等聯合應用的方法，會出現周期延長的特點，因此，探討慢性支氣管炎發生機制并篩選有效的預防或治療的藥物至關重要。藏藥檀香清咽片由檀香、叢菔、紫花亞菊、唐古特烏頭、秦艽花和青藏龍膽組成，具有“清熱解毒、止咳化痰、潤肺利咽”的功效，臨床已經證實對咽喉炎、支氣管炎等呼吸道感染引起的咳嗽、咳痰、氣喘等癥狀有明顯的的治療效果。CB的發病機制極其復雜，支氣管肺組織細胞內信號傳導級聯激活釋放細胞因子(TNF-α、IL-10)和炎性介質(NF-κB)在其中發揮著重要作用[3-4]。因此，本研究通過觀察檀香清咽片對脂多糖煙霧誘導慢性支氣管炎模型大鼠支氣管肺炎性浸潤程度、炎性介質MyD88/NF-κB/ICAM-1信號通路的影響，以期為民族藥的開發提供一定的理論基礎。

1 材料

1.1 動物SD大鼠，70只，♂，SPF級，體質量(180～220) g；由湖南省斯萊克景達實驗動物有限公司提供。實驗動物許可證號：SCXK(湘)2019-0004，合格證編號：430727211100275116。實驗程序根據湖南省中醫藥研究院實驗動物中心SOP進行，所有程序均按照中國科學技術部制定的“實驗動物護理和使用指導意見”進行，批準編號：2021-0007。允許大鼠在恒定溫度、濕度和光暗循環[(20～26) ℃; 40%～70%；07 ∶00～19 ∶00光照循環]下自由飲水和進食。

1.2 儀器Envision2105型酶標儀(PE公司)；RM2245型輪轉式切片機(德國Leica公司)；奧林巴斯BX53型生物顯微鏡(Olympus 公司)；7DZ5-WS型低溫低速離心機(湖南湘儀實驗儀器公司)；PANNORAMIC型全景切片掃描儀(匈牙利3DHISTECH公司)；DYY-6C型電泳儀(北京六一)；DYCP-31DN型水平瓊脂糖電泳槽(北京六一)；ChemiDocTMXRS+型凝膠成像系統(美國Bio-Rad公司)。

1.3 藥物及試劑檀香清咽片(批號20201101)，由檀香、叢菔、紫花亞菊、唐古特烏頭、秦艽花、青藏龍膽6味藥組成，比例為：37 ∶37 ∶37 ∶30 ∶30 ∶30，由湖南省中醫藥研究院中藥研究所制劑室提供并制成超微粉，臨床使用劑量為4 g生藥·d-1，按照體表面積換算成大鼠等效劑量為0.36 g·kg-1，檀香清咽片高、中、低劑量即為臨床等效劑量的4倍、2倍、1倍(1.44、0.72、0.36 g·kg-1)；陽性藥：桂龍瑞咳寧片(批號：200403，1 g·kg-1)，江西藥都仁和制藥有限公司；脂多糖(LPS，Sigma公司，批號：L2880)；TNF-α和IL-10 ELISA試劑盒(Elabscience公司，批號：E-EL-R2856c，E-EL-R0016c)；MyD88一抗(ABclona公司，批號：A0786)，NF-κB一抗(Proteintech公司，批號：66535-1-Ig)，ICAM-1一抗(Proteintech公司，批號：10020-1-AP)，肌動蛋白(actin，Proteintech公司，批號：66009-1-Ig)；HRP標記山羊抗兔(Proteintech公司，批號：SA00001-2)；HRP標記山羊抗大鼠(Proteintech公司，批號：SA00001-1)；trizol(美國Sigma公司，批號：V900483)；SuperECL Plus 超敏發光液(美國advansta公司，批號：K-12045-D50)。

2 方法

2.1 慢性支氣管炎大鼠模型建立SD大鼠適應性喂養5 d后，按體重隨機分為：正常組(n=8)、假手術組(n=8)和模型組(n=54)，模型組造模方法：每天將大鼠置于煙熏箱內，進行兩次煙熏，上下午各一次，每次熏1 h，每次煙熏量為10支香煙，兩次煙熏之間間隔4 h(手術當天取消熏煙)。d 15，模型組大鼠采用1%戊巴比妥鈉溶液(50 mg·kg-1)腹腔麻醉后，固定在板上，暴露聲門，將200 μg(2 g·L-1)LPS溶液快速注入氣管，然后將固定板垂直旋轉，使脂多糖均勻分布于兩肺，在造模后，大鼠禁食不禁水6 h。

2.2 分組與給藥在熏煙15 d后，將上述模型組大鼠按體重隨機分為模型組、陽性藥(桂龍瑞咳寧片1 g·kg-1)組、檀香清咽片高、中、低劑量(1.44、0.72、0.36 g·kg-1)組，每組10只。繼續煙熏造模的同時，藥物干預組灌胃給予相應藥物，正常組、假手術組和模型組給予等體積純凈水，連續給藥15 d。

2.3 一般行為、體征與解剖觀察實驗過程過中每周稱定動物體質量以調整用藥劑量，并詳細觀察動物背毛、眼、耳、尾，精神狀態和活動等情況。

2.4 樣本采集和制備因為手術后每組動物有一定的死亡率，給藥結束后次日，各組選取7只大鼠，采用1%戊巴比妥鈉溶液(50 mg·kg-1)腹腔麻醉，腹主動脈取血，離心(3 000 r·min-1，15 min)，取上清液，-80 ℃保存待用。然后，打開大鼠胸腔，完整取出全部支氣管肺組織，右側肺臟液氮凍存備用；左側肺組織10%中性甲醛溶液固定備用。

2.5 血清炎癥因子檢測將凍存的血清樣本梯度放入-20 ℃和4 ℃解凍后，試劑盒平衡到室溫，配制洗滌液、標準工作液、生物素化抗體工作液、酶結合物工作液，按照Elisa試劑盒說明書步驟加樣、溫育、洗板、檢測血清中TNF-α、IL-10含量變化。

2.6 支氣管肺組織病理切片HE染色各組大鼠支氣管和左側部分肺組織制成石蠟切片。將脫蠟的切片放染色架上，蘇木精染色，1%的鹽酸內分色。水洗，溫水或弱堿性水溶液反藍，伊紅染色，脫水，封片。通過光學顯微鏡觀察肺組織形態學變化(400×)。實驗動物造模成功的主要表現為支氣管周圍炎癥細胞浸潤狀況，管腔內有無滲出物，肺泡壁間質炎及肺泡氣腫改變等。支氣管炎癥浸潤程度：觀察切片中所有支氣管炎癥細胞浸潤情況，計數炎細胞浸潤支氣管和非浸潤支氣管數目，進行統計學比較。

2.7 Western blot法定量檢測MyD88/NF-κB/ICAM-1蛋白表達將支氣管肺組織剪碎，在冰上勻漿，加入裂解液裂解30 min，12 000 r·min-14 ℃離心5 min，取上清液進行蛋白定量，調整蛋白量后，取等量裂解產物，加入上樣緩沖液進行SDS-PAGE電泳，電泳后轉移至PVDF膜上，加入脫脂牛奶中室溫封閉2 h，加入一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗滌，加入相應二抗室溫孵育1 h，TBST洗滌，化學發光法顯色，成像掃描分析系統保存圖像。以actin蛋白表達水平作為內參，以各樣本與相應內參灰度值比值為蛋白相對含量。

2.8 免疫組織化學法檢測MyD88/NF-κB/ICAM-1蛋白表達取固定的肺組織進行石蠟包埋，自動切片機切取厚度為0.4 μm的組織切片。用二甲苯及系列乙醇脫蠟脫水；PBS沖洗，3% H2O2室溫孵育10 min滅活內源性過氧化物酶；PBS沖洗；10%正常山羊血清(PBS稀釋)封閉，室溫孵育10 min；滴加1 ∶50兔抗大鼠一抗，4 ℃過夜；滴加生物素標記二抗，37 ℃孵育30 min；DAB顯色；沖洗，終止顯色；蘇木精復染、脫水、封片，在光學顯微鏡(100×)下觀察每張載玻片3個不重復視野并統計MyD88、NF-κB和ICAM-1的陽性細胞率。

3 結果

3.1 檀香清咽片對慢性支氣管炎大鼠一般情況的影響造模后，模型組大鼠皮毛光澤逐漸喪失、活動量減少、情緒倦怠，飲水量和排尿量明顯增加，可以聽到氣道哮鳴音和痰鳴音，體質量明顯減輕(P<0.01)；給予檀香清咽片藥物干預后，氣道哮鳴音明顯緩解。體質量變化情況見Tab 1。

Tab 1 Effects of Tanxiang Qingyan Tablets on body mass of rats with chronic bronchitis

3.2 檀香清咽片對慢性支氣管炎大鼠血清炎癥因子的影響與假手術組比較，模型組大鼠血清中TNF-α含量明顯升高，IL-10含量明顯降低；與模型組比較，檀香清咽片高、中劑量組可明顯降低血清TNF-α含量(P<0.05，P<0.01)，但對IL-10含量改變差異無統計學意義。見Tab 2。

Tab 2 Effects of Tanxiang Qingyan Tablets on serum inflammatory factors in rats with chronic bronchitis

3.3 檀香清咽片對慢性支氣管炎大鼠支氣管肺組織病理形態的影響正常組大鼠支氣管黏膜上皮細胞完整，無充血水腫現象，細胞排列整齊，肺組織結構肺泡無明顯病理改變；模型組大鼠支氣管黏膜上皮細胞受損嚴重，大量壞死脫落，杯狀細胞增生，管壁大量纖維組織增生，管壁明顯增厚，管腔狹窄，管腔內充滿分泌物及滲出物，肺泡隔增寬，有不同程度的炎細胞浸潤及毛細血管擴張充血，非浸潤支氣管數減少(P<0.01)；與模型組比較，陽性藥組大鼠肺組織損傷和炎性改變減輕較為明顯，支氣管黏膜上皮無嚴重受損，管腔和肺泡腔內少有壞死脫落細胞及滲出物，見少量纖維組織及炎細胞浸潤，水腫、充血不明顯。檀香清咽片組大鼠支氣管黏膜上皮受損程度較輕，管腔和肺泡腔內有少量壞死脫落細胞及滲出物，肺組織損傷和炎性改變減輕，管壁增厚，肺泡隔增寬，見少量纖維組織及炎細胞浸潤水腫(P<0.05，P<0.01)。見Fig 1，Tab 3。

Fig 1 Effect of Tanxiang Qingyan Tablets on pathological morphology of bronchopulmonary tissues in rats with chronic bronchitis (HE×400)

Tab 3 Effects of Tanxiang Qingyan Tablets on infiltration of bronchial inflammatory cells in rats with chronic bronchitis

3.4 檀香清咽片對慢性支氣管炎大鼠支氣管肺組織MyD88/NF-κB/ICAM-1蛋白表達的影響與假手術組比較，模型組大鼠支氣管肺組織MyD88、NF-κB和ICAM-1蛋白灰度值和陽性表達率明顯上升(P<0.05，P<0.01)；與模型組比較，陽性藥組和檀香清咽片組大鼠支氣管肺組織MyD88、NF-κB和ICAM-1蛋白灰度值和陽性表達率陽性表達率明顯下調，差異具有統計學意義(P<0.05，P<0.01)。見Fig 2，3，Tab 4，5。

Fig 2 Effect of Tanxiang Qingyan Tablets on MyD88/NF-κB/ICAM-1 protein bands in bronchopulmonary tissues of rats with chronic bronchitis

Tab 4 Effect of Tanxiang Qingyan Tablets on gray value of MyD88/NF-κB/ICAM-1 protein in bronchopulmonary tissues of rats with chronic bronchitis

Tab 5 Effect of Tanxiang Qingyan Tablets on positive rate of MyD88/NF-κB/ICAM-1 protein expression in bronchopulmonary tissues of rats with chronic bronchitis

4 討論

我國的慢性支氣管炎發病率約為4.0%，老年患者約占6%～20%，嚴重影響人類的生活質量[5]。CB的生理病理過程主要是中央氣道上皮受損、炎癥細胞浸潤、平滑肌細胞肥大等；炎癥反應是CB發生發展的核心機制，多種炎癥因子間相互作用，繼發黏液高分泌、上皮免疫功能下降、氣道表面脫水及氣道重塑[6]。減少細胞因子和炎癥介質等促炎因素的產生成為治療CB的關鍵。

Fig 3 Results of immunohistochemical staining of MyD88，NF-κB and ICAM-1 proteins in bronchopulmonary tissues of rats in each group (×100)A: Control B: Sham C: Model D: Positive drug E: High F: Medium G: Low

本研究采用熏煙法聯合脂多糖(LPS)誘導CB模型，LPS是重要的致炎因子，可引起氣道上皮細胞損傷，誘發氣道炎癥。LPS與細胞膜上Toll受體結合可誘導一系列復雜炎癥反應，髓樣分化因子88(MyD88)是Toll信號的一種關鍵連接分子，很好的反應機體炎癥損害程度[7-8]。NF-κB由p50/p65亞單位形成的異源二聚體存在于細胞漿中，可與多種細胞基因的增強子或啟動子特異性結合，是調控炎癥過程中的關鍵因子。MyD88依賴的Toll途徑可促進炎癥因子的產生，從而激活NF-κB信號通路，誘發多種炎癥因子(如IL-1β、IL-6、TNF-α、ICAM-1等)的表達，導致巨噬細胞、中性粒細胞等免疫細胞在炎癥部位的聚集和浸潤[9-10]。以往研究發現，NF-κB在介導呼吸道炎癥中發揮重要作用，已成為治療CB的潛在靶點[11]。細胞間黏附分子1(ICAM-1)作為NF-κB的下游炎癥遞質，主要參與細胞識別、活化和信號傳導，在免疫應答和炎癥發生等方面具有重要作用[12]。機體正常情況下低水平表達，出現組織損傷后，可經NF-κB調控和白介素等炎性因子誘導活化，與白細胞表面淋巴細胞功能相關抗原相互作用，促使相關抗原陽性白細胞黏附于ICAM-1陽性內皮細胞表面，進一步到達炎癥組織，促進炎癥細胞的遷移和趨化[13-14]。

TNF-α是LPS介導CB發病過程中最早釋放的主要前炎性細胞因子之一，也是NF-κB信號通路的下游分子，能夠激活免疫細胞促進炎癥因子的釋放，進而介導肺組織炎癥反應的過程，誘發或加重支氣管炎癥[15]。IL-10具有抑制促炎細胞因子合成與釋放的抗炎作用，是一種多細胞源多功能細胞因子[16]。本研究ELISA檢測CB模型大鼠外周血清中TNF-α和IL-10含量，發現檀香清咽片可有效調控促炎因子TNF-α的水平，但對IL-10的水平改變無顯著性差異，針對抑炎因子是否有調控作用后續將采用多種方法進一步驗證。

本研究另外采用Western blot法和免疫組織化學雙重定量定性考察炎性介質MyD88、NF-κB和ICAM-1蛋白在CB模型大鼠支氣管肺組織中的表達情況，發現檀香清咽片可明顯抑制CB模型大鼠MyD88/NF-κB/ICAM-1信號通路的激活，減少支氣管肺組織的炎性浸潤，改善氣道和肺部炎癥狀況。本研究HE染色結果也表明，檀香清咽片可有效改善CB模型大鼠支氣管黏膜炎癥細胞浸潤程度，減少杯狀細胞和管壁大量纖維增生，增加管腔內徑，緩解支氣管肺部炎癥。檀香清咽片可有效改善支氣管肺組織炎性浸潤，可能與減少炎性介質TNF-α等的釋放，可能與調控MyD88/NF-κB/ICAM-1信號通路表達有關。本研究從炎癥介質調控方面探討了檀香清咽片治療慢性支氣管炎作用和機制，其他作用機制需進一步研究證實。