基于網絡藥理學探討健脾補腎活血方治療缺血性卒中的作用機制

李夢君，喬戰科，劉向哲，孫永康，冉春龍，白 琛，方曉艷

(1.河南中醫藥大學，河南 鄭州 450046；2.河南中醫藥大學第一附屬醫院腦病一區，河南 鄭州 450000；3.河南中醫藥大學藥學院，河南 鄭州 450046)

缺血性卒中(ischemic stroke，IS)是由高血壓、糖尿病、高脂血癥及體內高凝狀態等多種危險因素導致腦血流量降低、腦部缺血缺氧引發神經功能缺損的一種疾病[1,2]。根據中國2019年流行病學調查顯示，缺血性卒中的發病率、患病率、復發率、死亡率逐年攀升，總體發病風險仍位居世界首位[3]，這種持續上升的形勢依然嚴峻。健脾補腎活血方(Jianpi Bushen Huoxue Prescription，JPBSHXP)由河南中醫藥大學第一附屬醫院腦病專家團隊擬定，已在臨床應用十余年。該方針對缺血性卒中本虛標實的基本病機，以健脾補腎，活血通絡為治療原則。方中黃芪、黨參、白術健脾益氣；牛膝、杜仲、桑寄生、肉蓯蓉補腎固本；丹參，川芎活血通絡；石菖蒲化痰開竅；炙甘草調和諸藥。前期研究表明，JPBSHXP可提高缺血性卒中患者腦缺血區灌注水平，減輕神經功能缺損，改善中醫證候、臨床癥狀和體征，提高日常生活能力[4]，但其作用機制尚不明確。網絡藥理學是從分子層次闡釋中藥方劑作用原理的有效方法，本文旨在應用網絡藥理學的分析方法，通過靶點的篩選、通路分析以及分子對接技術，為驗證該方治療IS的有效性提供合理依據，同時為此方進一步研究提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 材料本文所需數據庫及相關應用程序，如Tab 1。

Tab 1 Related databases and application software

1.2 方法

1.2.1健脾補腎活血方化學成分及靶點的獲取 利用TCMSP中藥系統藥理數據庫及分析平臺檢索健脾補腎活血方11味中藥的有效活性成分及對應靶點信息，根據藥代動力學參數吸收、分布、代謝和排泄(ADME)的原則，以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%，類藥性(Drug-like，DL)≥0.18為條件篩選潛在化合物，OB、DL越高，說明藥物在體內發揮效能的作用越強[5]。使用Perl語言將11味中藥整理合并，得到健脾補腎活血方的中藥-活性成分-靶點的總體信息表。

1.2.2收集疾病靶點及預測藥物作用靶點 通過Genecards、OMIM、DrugBank、TTD、PharmGkb五種疾病數據庫，以“Ischemic stroke”為關鍵詞，查找IS的疾病基因靶點，用R語言程序將其合并；Genecards數據庫獲取基因分值越高與疾病相關性越強，選擇分值大于1與IS相關性高的靶點進行研究；在Uniprot平臺將所有關于人的及被證實的基因下載，并通過perl語言將藥物靶點轉換為基因ID編碼的形式；取藥物和疾病的共同靶點并繪制venn圖，預測藥物靶點。

1.2.3中藥復方網絡的構建 設計perl語言程序對健脾補腎活血方與缺血性卒中相同靶點進行整理，應用Cytoscape 3.8.0軟件構建JPBSHXP-活性成分-靶點和IS相互作用的調控信息網絡圖，應用拓撲插件計算介數中心性(betweenness centrality，BC)，緊密中心性(closeness centrality，CC)，度值(degree centrality，DC )，特征向量中心性(eigenvector centrality，EC)，局部平均連通度中心性(local average connectivity centrality，LAC)，通過DC、BC篩選該方核心活性成分。

1.2.4蛋白互作(PPI)網絡的構建 通過String平臺構建PPI蛋白互作網絡，將藥物與疾病交集所得到的190個基因導入List Of Names，設置highest confidence為0.9，去除游離靶點后得到170個靶點，應用Cytoscape3.8.0進行PPI網絡分析，拓撲參數取大于BC、CC、DC、EC、LAC的中位值得到核心靶點。

1.2.5GO 功能分析和KEGG信號通路富集分析 應用David數據庫進行GO分析及KEGG信號通路富集分析，根據P值提取前20名的生物學過程(biological process，BP)、細胞組成(cellular components，CC)、分子功能(molecular function，MF)及信號通路的數據，運用微生信在線制圖進行氣泡圖的繪制。

1.2.6分子對接 使用分子對接技術研究JPBSHXP的活性成分與治療IS的相關靶點。首先，從pubchem數據庫下載化合物結構，保存為SDF格式，并通過Chem 3D軟件將SDF格式轉化為mol2格式，從RCSB數據庫下載相關蛋白，使用Pymol軟件去除溶劑分子與配體，使用AutoDock Tools 1.5.6軟件計算電荷、加氫等。最后運行Autodock vina 1.1.2進行分子對接, 采用Discovery Studio 2020可視化分析對接構象。

2 結果

2.1 成分及靶點的篩選根據TCMSP得到JPBSHXP中藥-活性成分-靶點(單位：個)，其中黃芪-17個-462個、黨參-17個-214個、白術-4個-23個、杜仲-26個-519個、桑寄生-2個-157個、懷牛膝-17個-444個、肉蓯蓉-6個-223個、丹參-59個-932個、川芎-6個-42個、石菖蒲-4個-103個、甘草87個-1 761個。共有活性成分245個，靶點4 880個，剔重后取得該方有效成分201個，靶點263個。

2.2 疾病靶點及預測藥物作用靶點通過R語言設計程序將疾病基因合并、剔除重復項并取唯一值，得到2 808個疾病靶點。藥物靶點與疾病靶點相交集得到共同基因190個。(詳見Fig 1)。

Fig 1 Venn diagram of drug-disease target intersection

2.3 健脾補腎活血方網絡構建及拓撲分析通過Sytoscape 3.8.0構建中藥-活性成分-靶點-疾病網絡圖。Network Analyzer計算分析得到398個節點，2 118條邊。拓撲研究顯示健脾類藥物主要化學成分槲皮素(quercetin)、山柰酚(kaempferol)、木犀草素(luteolin)等。其中槲皮素、山柰酚、豆甾醇為健脾類、補腎類共有活性成分，其余補腎類藥物顯著化學成分有漢黃芩素(wogonin)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)等。活血類藥物為丹參、川芎，研究顯示發揮活血作用的藥物為丹參，主要有丹參酮IIA(tanshinone iia)、隱丹參酮(cryptotanshinone)等化合物(Tab 2)。

Tab 2 Potential active ingredients of JPBSHXP

2.4 PPI網絡構建及分析將190個交集基因導入String數據庫，置信度設置為0.9，并剔除游離靶點，共得到170個基因，將170個基因通過sytoscape 3.8.0進行網絡可視化分析和拓撲分析。根據拓撲分析結果，取BC>58.4、DC>7、CC>0.11、EC>0.03、LAC>3(中位值)的靶點作為該方的核心基因。STAT3、Tp53、MAPK1、MAPK3、JUN、APP、MAPK14、MAPK8、AKT1、EGFR、VEGFA等基因可能是該方防治缺血性卒中的潛在靶點(Fig 2)。

Fig 2 Network diagram of potential targets

2.5 GO富集分析和KEGG通路富集分析GO分析共得到880個分析條目，其中生物學過程有662條，最多對應交集基因有40個，最少2個；細胞組成有82條，最多對應交集基因有87個，最少2個；分子功能有136條；最多對應交集基因有150個，最少2個。根據排名前20的GO條目分析顯示，健脾補腎活血方治療缺血性卒中可能與對藥物的反應、對缺氧的反應、對乙醇的反應、對脂多糖的反應、對雌二醇的反應、老化等生物學過程密切相關，分子生物學功能集中在酶結合、蛋白質均二聚活性、血紅素結合、類固醇結合、轉錄因子結合、多巴胺結合、蛋白激酶結合、多巴胺神經遞質受體活性等方面，細胞組分主要有細胞外空間、膜筏、質膜等。

KEGG富集分析共得到125條通路，主要與癌癥通路、乙型肝炎、弓形蟲病、大腸癌、TNF信號通路、膀胱癌、胰腺癌、蛋白聚糖在癌癥中、HIF-1信號通路、前列腺癌、局灶性粘連、丙型肝炎、PI3K-Akt信號通路、細胞凋亡、Toll樣受體信號通路等密切相關(Fig 3)。

Fig 3 Visual analysis diagram of biological process, cell composition, molecular function and KEGG

2.6 分子對接Quercetin、Tanshinone IIa、Luteolin、Kaempferol與STAT3、Tp53、MAPK3、MAPK1、JUN、APP、AKT1關鍵靶蛋白進行28次對接，結果顯示靶點與化合物均有較強的結合能(Tab 3)。Quercetin主要是健脾補腎藥物共有活性成分，β淀粉樣前體蛋白(APP)與Quercetin結合較強，Tanshinone IIa為活血藥物主要成分，主要與轉錄因子AP-1(JUN)、絲裂原活化蛋白激酶3(MAPK3)、絲裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)等化合物結合具有較好的穩定性(Fig 4)。另外，氫鍵使結構更具穩定性。例如，APP與Quercetin的a環Arg381、Pro385形成氫鍵作用；b環與Arg500、Tyr369形成氫鍵作用；c環與Ala334、Glu362、Tyr501形成氫鍵作用。

Tab 3 Molecular docking results

3 討論

課題組成員前期多角度、多層次闡釋健脾補腎活血方治療缺血性卒中的藥理機制。實驗研究表明,該方通過抑制CD3+、CD8+和調節CD4+淋巴細胞在缺血/再灌注損傷后腦組織內的浸潤，減少免疫應答所介導的神經細胞凋亡，增加大鼠外周血中內皮組細胞(EPCs)的含量，增強腦組織CD31抗原的表達，促進大鼠腦組織新生血管的形成、有效建立側支循環，從而減輕腦損傷。臨床試驗也顯示，該方明顯增加患者外周血EPCs含量，提高缺血區血液灌注水平、改善細胞免疫、拮抗炎癥反應，減少卒中后氧化應激反應，增強機體抗氧化應激能力，同時修復受損的血管內皮細胞[4,6-8]。

Fig 4 Molecular docking diagram

Tab 4 Signaling pathway of JPBSHXP in treating IS

拓撲分析得出槲皮素、木犀草素、山柰酚、丹參酮IIA可能是JPBSHXP治療IS的關鍵化學成分。Oh等[9]將槲皮素應用于缺血/再灌注誘導小鼠模型中發現，抑制在細胞活化期間由糖蛋白VI介導的血小板信號轉導，明顯破壞膠原相關肽誘導的血小板聚集，減少顆粒分泌及活性氧生成，降低細胞內鈣動員水平，抑制動脈血栓形成。木犀草素通過抑制基質金屬蛋白酶(MMP)9和激活PI3K/Akt信號通路增強細胞活力，并下調細胞凋亡，減少了腦梗塞體積[10]。山柰酚促進血管內皮生長因子(VEGF)誘導血管內皮生長因子受體2(VEGFR2)磷酸化、內皮一氧化氮合酶(eNOS)和細胞外信號調節激酶(Erk)表達，從而促使內皮細胞增殖、遷移和血管新生[11]。徐璇實驗得出丹參酮IIA可使腦缺血大鼠的PTEN表達增強，降低自噬通路PI3K/AKT/mTOR的表達水平，減輕腦缺血后炎癥反應，保護大鼠的腦組織[12]。該方治療IS的核心靶點有STAT3、TP53、MAPK1、MAPK3、APP、JUN、AKT1等。轉錄激活因子3(STAT3)廣泛存在于中樞神經系統中，參與細胞生長、代謝、凋亡，血管生成和氧化應激等多種生物學途徑，同時介導機體免疫失調、炎癥反應等過程[13]。余錄等[14]研究發現山柰酚糖苷可能通過STAT3信號通路減少卒中后TNF-α、IL-1β炎性因子，降低白質區胼胝體和紋狀體的β淀粉樣前體蛋白(APP)陽性表達，改善大鼠神經行為障礙，縮小腦梗死范圍，減輕神經元損傷。

Fig 5 The key pathway of JPBSHXP possible to promote neovascularization

健脾補腎活血方作用于缺血性卒中的炎癥通路有腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)信號通路、Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)信號通路；促血管新生通路主要是低氧誘導因子-1(hypoxia inducible factor-1，HIF-1α)信號通路、磷脂酰肌醇-3-激酶/絲蘇氨酸蛋白激酶(phosphatei-dylinositol-3-kinase/serine-threonine kinase，PI3K /Akt)通路(Tab 4，Fig 5)。腦梗死急性期常出現大量的炎癥因子，TNF信號通路富集基因顯示可能調節IL-1β及CCL2、CXCL10、NFKBIA等致炎因子來對抗腦缺血。Toll樣受體信號通路參與神經炎癥的反應過程[15]，可能是通過MAPK信號通路，調控轉錄因子AP-1，調節下游基因IL-8、IL-1β、NFKBIA、IKBKB、CXCL10、CXCL11等炎性因子參與中風后炎性反應。這也為未來臨床及實驗研究炎癥信號通路方向提供新的研究指標。PI3K/Akt通路，參與多種通路的調節，與炎癥免疫反應、細胞凋亡、HIF-1α等通路均有相關性[16-17]。PI3K-Akt通路得出該方可能是調控GF、RTK、ECM等上游蛋白，使PI3K激活，AKT磷酸化啟動下游PKCs、eNOS、ERK、GSK3、p21、Bcl-2、Bax、caspase-9等靶蛋白來作用于缺血性卒中。以上得知健脾補腎活血方可能通過免疫、炎癥反應、氧化應激、血管新生、細胞凋亡等途徑作用于缺血性卒中。

網絡藥理學通過生物信息學、計算機技術、藥理學等對方劑進行現代化闡釋，為新藥創制研發提供思路，也給予關鍵的技術支撐，對后續實驗研究指明有希望的驗證方向。本研究通過該方法得出缺血性卒中的潛在化學成分、小分子蛋白以及信號通路，在分子生物學層面為該方進一步實驗研究及臨床應用提供了理論基礎。中醫藥在傳承中發展，在發展中創新，中藥新藥以證候為干預對象，以辨證論治為理論基礎，具有異病同治的特征。臨床研究中本方對脾腎兩虛型腦梗死、卒中后認知障礙和腦白質病變具有明顯療效，是否通過調控這些通路、靶蛋白發揮作用，有待于課題組下一步實驗和臨床驗證。