基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)探討鐵死亡相關(guān)基因在奧希替尼獲得性耐藥NSCLC細(xì)胞中的表達(dá)及意義

曹 霖，生高凡，江詩(shī)琴，黃 民，金 晶

(中山大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州 510006)

肺癌作為發(fā)病率和死亡率極高的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著人類的生存和健康[1]。其中非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)占比約80%，但患者的5年生存率卻不足20%[2]。目前，NSCLC的治療手段主要以手術(shù)、化療、放療、介入、免疫療法和靶向治療等為主，其中化療仍是主要治療方式之一，但其不良反應(yīng)也對(duì)患者的生活質(zhì)量造成了較大影響[3]。奧希替尼(osimertinib，Osi)作為第三代表皮生長(zhǎng)因子受體-酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)類藥物，針對(duì)廣泛存在的EGFR T790M突變導(dǎo)致的吉非替尼耐藥而開發(fā)，不僅具有比前兩代藥物更好的療效，同時(shí)對(duì)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的腫瘤轉(zhuǎn)移也有一定的作用[4-5]。然而，Osi的耐藥依舊限制了其長(zhǎng)期的臨床應(yīng)用，并最終致使癌癥進(jìn)展惡化。因此，探究Osi耐藥的產(chǎn)生機(jī)制顯得尤為重要。

轉(zhuǎn)錄組學(xué)是指在特定的細(xì)胞、組織或生物體中針對(duì)特定的發(fā)育階段或生理?xiàng)l件對(duì)完整的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行研究，這套完整的轉(zhuǎn)錄本就稱為一個(gè)轉(zhuǎn)錄組，主要包括mRNA、rRNA、tRNA、ncRNA、miRNA和lncRNA等[6]。RNA-seq作為一種比較成熟的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究方法，主要通過將RNA轉(zhuǎn)化為cDNA片段文庫(kù)并進(jìn)行深度高通量測(cè)序，從而獲得研究目標(biāo)的轉(zhuǎn)錄組，具有檢測(cè)范圍廣、背景信號(hào)低、樣本用量少等優(yōu)點(diǎn)[7]。近年來，轉(zhuǎn)錄組學(xué)已被應(yīng)用于識(shí)別疾病的生物標(biāo)志物，以及研究各種刺激和應(yīng)激導(dǎo)致的生物學(xué)反應(yīng)，并在推動(dòng)基因組和分子生物學(xué)研究中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[8]。

本研究以人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞H1975細(xì)胞、及其Osi獲得性耐藥株H1975/OR細(xì)胞為研究對(duì)象，基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)初步探討了鐵死亡通路在Osi耐藥中可能發(fā)揮的作用，為進(jìn)一步進(jìn)行Osi的耐藥機(jī)制研究提供支持，并為克服Osi治療肺癌出現(xiàn)的耐藥性提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞株 人肺成纖維細(xì)胞HLF-1和人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞H1975購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，人非小細(xì)胞肺癌Osi耐藥細(xì)胞H1975/OR由澳門大學(xué)陸金健教授課題組饋贈(zèng)。

1.1.2試劑 DMEM培養(yǎng)基(批號(hào)：10013043)、胎牛血清(批號(hào)：08020001)、青霉素-鏈霉素溶液(批號(hào)：30002351)購(gòu)自美國(guó)Corning公司；CCK-8試劑盒(批號(hào)：230078)購(gòu)自上海畢傲圖生物科技有限公司；RPMI 1640培養(yǎng)基(批號(hào)：8121327)、0.25%胰蛋白酶-EDTA(批號(hào)：2193232)、PBS緩沖液(批號(hào)：8120140)、BCA試劑盒(批號(hào)：VL319460)購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司；RNAex Pro TRIzol試劑(批號(hào)：A2A0207)購(gòu)自廣州瑞真生物科技有限公司；Osimertinib(批號(hào)：1-NJL-79-1)購(gòu)自加拿大Toronto Research Chemicals(trc)公司；RSL3(批號(hào)：1219810-16-8)、Erastin(批號(hào)：571203-78-6)購(gòu)自上海陶素生化科技有限公司；RIPA蛋白裂解液購(gòu)自上海博彩生物科技有限公司；PVDF膜(批號(hào)：R1CB59666)、ECL化學(xué)發(fā)光液(批號(hào)：2017802)購(gòu)自美國(guó)Millipore公司; 兔抗TFR1抗體(批號(hào)：00026160)購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司；兔抗FPN(批號(hào)：A20180627764)、FTH(批號(hào)：A20180627766)、FTL(批號(hào)：A20180627765)抗體購(gòu)自武漢云克隆科技股份有限公司；兔抗SLC7A11(批號(hào)：4000000753)、GPX4(批號(hào)：3561103009)抗體購(gòu)自武漢愛博泰克生物科技有限公司；兔抗β-actin抗體(批號(hào)：18)、HRP標(biāo)記的兔二抗(批號(hào)：30)購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology(CST)公司。

1.1.3儀器 二氧化碳培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Fisher公司)；IX73研究級(jí)倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司)；低溫高速離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)；電泳及電轉(zhuǎn)系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司);Image Quant LAS4000 曝光成像儀(美國(guó)General Electric公司)；多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo Fisher公司)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) HLF-1細(xì)胞接種于含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，H1975細(xì)胞和H1975/OR細(xì)胞接種于含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H1975細(xì)胞和H1975/OR細(xì)胞以5×107·L-1的密度分別接種于96孔板中，每孔100 μL。培養(yǎng)24 h后，加入100 μL含不同濃度Osi、RSL3或Erastin的培養(yǎng)液，用RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋藥液，使其終濃度分別為：Osi(0.001、0.01、0.1、1、10 μmol·L-1)，RSL3(25 nmol·L-1)，Erastin(2 μmol·L-1)，并設(shè)置空白對(duì)照組，每組5個(gè)復(fù)孔。Osi培養(yǎng)72 h或RSL3、Erastin培養(yǎng)24 h后，吸棄培養(yǎng)液，另設(shè)3個(gè)空白復(fù)孔，每孔加入100 μL含10% CCK-8的無血清RPMI 1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)1 h后，酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm處的吸光度值OD，相對(duì)細(xì)胞存活率/%=(實(shí)驗(yàn)組OD-空白孔OD)/(對(duì)照組OD-空白孔OD)×100%。

1.2.3轉(zhuǎn)錄組學(xué)樣本處理及數(shù)據(jù)分析 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H1975細(xì)胞和H1975/OR細(xì)胞以1×109·L-1的密度分別接種于6孔板中，每孔2 mL。培養(yǎng)24 h后，顯微鏡下確定細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，終止培養(yǎng)。吸棄培養(yǎng)基，加入PBS洗滌細(xì)胞2次。每孔加入500 μL TRIzol，反復(fù)吹打至細(xì)胞充分裂解，轉(zhuǎn)移至耐-192 ℃低溫的螺紋口凍存管后，立即于液氮中進(jìn)行速凍，-80 ℃冰箱保存。

提取H1975和H1975/OR細(xì)胞的總RNA并進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，質(zhì)檢合格后進(jìn)行mRNA純化、片段化及雙鏈cDNA的合成與純化。然后通過末端修復(fù)、接頭連接及PCR擴(kuò)增等步驟，完成樣本文庫(kù)構(gòu)建并上機(jī)進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序平臺(tái)采用高通量Illumina Hiseq 4000測(cè)序儀，產(chǎn)出原始數(shù)據(jù)并進(jìn)行預(yù)處理，去除接頭和低質(zhì)量reads，與參考基因組進(jìn)行比對(duì)及統(tǒng)計(jì)，對(duì)基因和轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行表達(dá)豐度分析，根據(jù)FPKM值篩選獲得差異基因并對(duì)其表達(dá)譜進(jìn)行分析，對(duì)差異基因進(jìn)行GO功能富集性分析和KEGG通路富集性分析。樣本處理、上機(jī)測(cè)序及生物信息分析由杭州聯(lián)川生物技術(shù)股份有限公司完成。

1.2.4Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HLF-1細(xì)胞、H1975細(xì)胞和H1975/OR細(xì)胞以1×109·L-1的密度分別接種于6孔板中，每孔2 mL。培養(yǎng)24 h后，顯微鏡下確定細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，終止培養(yǎng)。吸棄培養(yǎng)基，加入PBS洗滌細(xì)胞2次。加入RIPA并于冰上裂解細(xì)胞30 min，刮取收集于1.5 mL EP管中超聲15 s，離心獲得總蛋白。進(jìn)行BCA蛋白定量后，加入上樣緩沖液，于干式恒溫器100 ℃加熱變性10 min。10% SDS-PAGE電泳分離后，電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入一抗TFR1、FPN、SLC7A11、FTL、FTH、GPX4、β-actin，4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育1 h，顯影。采用ImageJ軟件進(jìn)行灰度掃描分析結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 H1975細(xì)胞和H1975/OR細(xì)胞對(duì)Osi的敏感性差異為了驗(yàn)證H1975細(xì)胞和H1975/OR細(xì)胞對(duì)于Osi的敏感性存在差異，采用CCK-8法考察不同濃度Osi對(duì)兩種細(xì)胞存活率的影響。結(jié)果如Fig 1所示，隨著Osi濃度的增加，H1975細(xì)胞的存活率明顯下降，顯微鏡視野下也可明顯觀察到死細(xì)胞數(shù)目的增多，Osi對(duì)其的IC50為0.06 μmol·L-1。與之相比，H1975/OR細(xì)胞在顯微鏡視野下狀態(tài)良好，其存活率只在Osi濃度高于1 μmol·L-1時(shí)才出現(xiàn)了較為顯著的下降趨勢(shì)，IC50為4.23 μmol·L-1，說明H1975細(xì)胞對(duì)Osi的敏感性遠(yuǎn)強(qiáng)于獲得性耐藥的H1975/OR細(xì)胞。

Fig 1 Effect of Osi on cell viability of H1975 cells and

2.2 轉(zhuǎn)錄組學(xué)發(fā)現(xiàn)H1975細(xì)胞和H1975/OR細(xì)胞的鐵死亡通路存在差異為進(jìn)一步探究H1975/OR細(xì)胞對(duì)于Osi可能存在的耐藥機(jī)制，采用轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)對(duì)兩種細(xì)胞的基因表達(dá)差異進(jìn)行了分析比較，以差異倍數(shù)FC≥2或FC≤0.5為變化閾值，P值<0.05作為篩選差異基因的標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果如Fig 2所示，H1975/OR細(xì)胞與H1975細(xì)胞相比，其中71個(gè)差異基因上調(diào)，48個(gè)差異基因下調(diào)。

Fig 2 Volcano diagram of differential gene numbers between H1975 and H1975/OR cells

對(duì)差異基因進(jìn)行GO富集分析，主要包括生物學(xué)過程(biological process)、細(xì)胞組分(cellular component)、分子功能(molecular function)3類，結(jié)果如Fig 3所示。將GO富集分析結(jié)果繪制為氣泡圖，氣泡的顏色和大小分別表示每一項(xiàng)的P值大小和該項(xiàng)包含的差異基因數(shù)，如Fig 4所示。其中，生物學(xué)過程的富集結(jié)果顯示，H1975細(xì)胞和H1975/OR細(xì)胞的差異基因主要富集在DNA為模板的轉(zhuǎn)錄調(diào)控、多細(xì)胞組織發(fā)育、RNA聚合酶Ⅱ的轉(zhuǎn)錄調(diào)控、以及胞內(nèi)蛋白代謝等生物過程。細(xì)胞組分的富集結(jié)果顯示，差異基因主要分布在細(xì)胞核、細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、胞質(zhì)溶膠和核質(zhì)等細(xì)胞部位。分子功能的富集結(jié)果顯示，差異基因主要是通過影響蛋白、金屬離子、核酸等分子的結(jié)合以及轉(zhuǎn)移酶和水解酶等的功能而發(fā)揮作用。

Fig 3 GO functional enrichment of differential genes between H1975 and H1975/OR cells

Fig 4 Bubble diagram of GO functional enrichment of differential genes between H1975 and H1975/OR cells

對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG通路富集分析，將結(jié)果繪制為氣泡圖，氣泡的顏色和大小分別表示每種信號(hào)通路的P值大小和該條信號(hào)通路包含的差異基因數(shù)，如Fig 5所示。結(jié)果顯示，差異基因主要參與了甲狀腺激素合成、鐵死亡、膽固醇代謝、單純皰疹病毒1感染、長(zhǎng)壽調(diào)節(jié)途徑、AMPK等信號(hào)通路。其中，鐵死亡通路的富集程度和差異基因數(shù)均較高，提示鐵死亡信號(hào)通路的改變可能在Osi獲得性耐藥中扮演著重要角色。

Fig 5 Bubble diagram of KEGG enrichment of differential genes between H1975 and H1975/OR cells

2.3 HLF-1、H1975細(xì)胞和H1975/OR細(xì)胞的鐵死亡相關(guān)蛋白表達(dá)存在差異基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)所獲得的結(jié)果，為進(jìn)一步驗(yàn)證鐵死亡通路在Osi敏感與耐藥肺癌細(xì)胞上的差異，采用Western blot技術(shù)檢測(cè)了HLF-1、H1975和H1975/OR細(xì)胞部分鐵死亡通路相關(guān)的蛋白表達(dá)差異。如Fig 6所示，其中，除TFR1以外的蛋白在Osi耐藥H1975/OR細(xì)胞上相比H1975細(xì)胞均具有顯著的表達(dá)水平升高。同時(shí)，除FTH以外的蛋白在肺癌細(xì)胞H1975和H1975/OR細(xì)胞上都顯示出了比人肺成纖維細(xì)胞HLF-1更高的表達(dá)水平。

Fig 6 Ferroptosis pathway proteins expression level of HLF-1, H1975 and H1975/OR cells n=3)

2.4 鐵死亡誘導(dǎo)劑對(duì)H1975細(xì)胞和H1975/OR細(xì)胞存活率的影響為進(jìn)一步證實(shí)鐵死亡通路在Osi獲得性耐藥中的作用，采用CCK-8法考察兩種鐵死亡的誘導(dǎo)劑RSL3和Erastin對(duì)H1975細(xì)胞和H1975/OR細(xì)胞的存活率影響。如Fig 7所示，與對(duì)照組相比，RSL3在25 nmol·L-1時(shí)能明顯降低H1975/OR細(xì)胞的存活率，而對(duì)H1975細(xì)胞則只有略微的影響。同時(shí)，Erastin在2 μmol·L-1時(shí)也能明顯降低H1975/OR細(xì)胞的存活率，而對(duì)H1975細(xì)胞則無影響，表明Osi耐藥的H1975/OR細(xì)胞對(duì)于鐵死亡的誘導(dǎo)劑具有更高的敏感性。

Fig 7 Effect of RSL3 and Erastin on cell viability of H1975 cells and H1975/OR cells n=5)

3 討論

肺癌作為一種高發(fā)病率與高死亡率的惡性腫瘤，始終是影響人類健康與生存的一大難題，而現(xiàn)有的治療方式如化療和放療等均具有較嚴(yán)重的不良反應(yīng)。近年來，靶向治療不僅具有較低的毒副作用，同時(shí)也顯示出了更好的療效，在改善肺癌病人的生存情況方面取得了巨大突破。以吉非替尼、阿法替尼等為代表的第一、二代EGFR-TKIs顯著延長(zhǎng)了許多患者的生存期，已作為具有EGFR敏感型突變NSCLC患者的一線用藥[9]。然而，多數(shù)患者在接受10-14個(gè)月治療后均會(huì)顯示出耐藥性，其中50%以上是由于EGFR T790M突變所導(dǎo)致[10]。Osi作為第三代EGFR-TKI類靶向治療藥物，在對(duì)于具有EGFR T790M突變的非小細(xì)胞肺癌患者中具有顯著療效，同時(shí)，較少的不良反應(yīng)和對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤轉(zhuǎn)移的治療能力也使其在臨床得到廣泛使用[4]。然而，長(zhǎng)期使用后產(chǎn)生的耐藥性極大地限制了Osi在臨床的進(jìn)一步應(yīng)用，不同于前兩代EGFR-TKI較為普遍的T790M突變耐藥機(jī)制，目前對(duì)Osi的耐藥機(jī)制還存在著眾多說法。因此，探究Osi耐藥的機(jī)制并找到克服耐藥的方法是臨床研究急待解決的問題之一[11]。

隨著高通量測(cè)序技術(shù)發(fā)展成熟，生命科學(xué)對(duì)遺傳信息的研究已進(jìn)入了一個(gè)新的階段。RNA-seq作為研究轉(zhuǎn)錄組學(xué)的代表性方法，現(xiàn)在已廣泛應(yīng)用于對(duì)生命體各個(gè)層面的機(jī)制研究[6]。目前，RNA-seq的主要研究步驟包括：提取RNA并將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，對(duì)cDNA進(jìn)行末端修復(fù)、接頭連接等步驟并擴(kuò)增獲得cDNA文庫(kù)，對(duì)得到的cDNA文庫(kù)進(jìn)行高通量測(cè)序，并與參考基因組進(jìn)行比對(duì)分析獲得差異基因，以及差異基因的后續(xù)分析及可視化等步驟[7]。研究發(fā)現(xiàn)，通過對(duì)非小細(xì)胞肺癌H1975細(xì)胞及其Osi獲得性耐藥H1975/OR細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組學(xué)進(jìn)行分析，證實(shí)二者在基因表達(dá)水平差異較大。進(jìn)一步分析GO功能富集結(jié)果，二者在生物學(xué)過程、細(xì)胞組分、分子功能等方面均有著較大差異，而KEGG通路富集揭示了這些差異基因存在的信號(hào)通路，如甲狀腺激素合成、鐵死亡、膽固醇代謝、單純皰疹病毒1感染、長(zhǎng)壽調(diào)節(jié)途徑、AMPK等信號(hào)通路。其中，鐵死亡相關(guān)信號(hào)通路的差異尤為明顯，可能預(yù)示著鐵死亡在Osi耐藥的形成中扮演著必要的角色。

鐵死亡是由脂質(zhì)過氧化物的蓄積和隨后的質(zhì)膜破裂引起的鐵依賴性的調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡，在形態(tài)、生化與基因調(diào)控上均不同于凋亡與壞死[12]。鐵死亡可由外源性或內(nèi)源性途徑誘導(dǎo)，外源性途徑是通過抑制細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，如胱氨酸/谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(又稱system Xc-)或激活轉(zhuǎn)鐵蛋白等啟動(dòng)，內(nèi)源性途徑是通過阻斷胞內(nèi)抗氧化酶(如GPX4)激活[13]。目前鐵死亡被認(rèn)為是天然的腫瘤抑制機(jī)制，在許多癌癥療法，如放療、免疫療法和部分化療中發(fā)揮著重要作用，已發(fā)現(xiàn)部分癌癥相關(guān)通路與鐵死亡的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[14]。鐵死亡誘導(dǎo)劑Erastin和RSL3可對(duì)工程性RAS突變的腫瘤細(xì)胞選擇性致死，抑制RAS或其下游信號(hào)分子可逆轉(zhuǎn)Erastin和RSL3的作用[15]。NRF2信號(hào)通路可通過激活與鐵代謝、GSH代謝以及ROS解毒酶相關(guān)基因抵御鐵死亡過程中的氧化損傷[16]。在上皮-間質(zhì)-轉(zhuǎn)化(EMT)的過程中，鈣粘蛋白1介導(dǎo)的細(xì)胞間接觸可以保護(hù)細(xì)胞免遭鐵死亡，而SNAIL、TWIST1或ZEB1表達(dá)增加可恢復(fù)對(duì)鐵死亡的敏感性[17]。目前已發(fā)現(xiàn)多種獲批準(zhǔn)上市的藥物(如索拉非尼、青蒿素和他汀類)、電離輻射和細(xì)胞因子(如TGF-β1和IFN-γ)等可誘導(dǎo)鐵死亡，從而抑制腫瘤生長(zhǎng)[11]。但迄今為止，關(guān)于鐵死亡在腫瘤耐藥中發(fā)揮的作用還較少被研究。

鐵死亡相關(guān)的信號(hào)通路包含多種蛋白的調(diào)控作用，其中轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1(transferrin receptor 1，TFR1)介導(dǎo)的鐵攝取可促進(jìn)鐵死亡，而鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ferroportin，F(xiàn)PN)介導(dǎo)的鐵輸出則可抑制鐵死亡；組成鐵蛋白(ferritin)的FTH和FTL可介導(dǎo)胞內(nèi)鐵的存儲(chǔ)，其自噬降解會(huì)通過增加胞質(zhì)內(nèi)鐵的蓄積促進(jìn)鐵死亡的發(fā)生；SLC7A11所屬的system xc-負(fù)責(zé)將半胱氨酸導(dǎo)入細(xì)胞，隨后由GCL介導(dǎo)產(chǎn)生谷胱甘肽；GPX4可以直接將過氧化氫磷脂還原為羥基磷脂，從而作為癌細(xì)胞鐵死亡的中樞抑制因子[18]?；谵D(zhuǎn)錄組學(xué)的結(jié)果，通過比較兩株細(xì)胞以及正常細(xì)胞HLF-1的鐵死亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)負(fù)責(zé)鐵轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白TFR1、FPN，鐵存儲(chǔ)相關(guān)的蛋白FTL、FTH，以及介導(dǎo)清除過氧化脂質(zhì)相關(guān)的蛋白SLC7A11、GPX4等均有不同程度的變化，進(jìn)一步證實(shí)了鐵死亡信號(hào)通路的改變與腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及耐藥的產(chǎn)生有著密不可分的關(guān)系。對(duì)于鐵死亡的誘導(dǎo)劑RSL3和Erastin，H1975/OR細(xì)胞均顯示出了比H1975細(xì)胞更強(qiáng)的敏感性，說明誘導(dǎo)耐藥細(xì)胞鐵死亡增強(qiáng)可能成為解決Osi耐藥的途徑之一。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)了人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞H1975與其Osi耐藥細(xì)胞H1975/OR在多個(gè)細(xì)胞組分與信號(hào)通路中基因表達(dá)的差異，其中鐵死亡通路的變化顯著，并證實(shí)Osi耐藥細(xì)胞對(duì)鐵死亡誘導(dǎo)劑更加敏感。本研究為開展克服Osi耐藥的相關(guān)研究提供思路，并為誘導(dǎo)鐵死亡克服Osi耐藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)在中山大學(xué)藥學(xué)院臨床藥理研究所完成，衷心感謝提供指導(dǎo)與幫助的各位老師及同學(xué)。)