一例牛莢膜血清A型多殺性巴氏桿菌與傳染性胸膜肺炎的混合感染研究

杜 瑋 陳古麗 瑪依拉·艾尼瓦 阿曼古麗·牙森 汪 陽 苗書魁 汪 萍夏俊李威*

（1新疆畜牧科學院，新疆烏魯木齊 832003；2新疆維吾爾自治區動物疾病預防控制中心，新疆烏魯木齊 830000；3新疆維吾爾自治區獸藥飼料監察所，新疆烏魯木齊 830000；4新疆農業大學動物醫學學院，新疆烏魯木齊 830000）

巴氏桿菌病是由多殺性巴氏桿菌引起的在野 生動物和畜禽中廣泛傳播的傳染病。敗血癥和出血性炎癥為急性病例的特征，由此被稱為出血性敗血癥[1]，表現為皮下、關節以及各臟器的局灶性化膿性炎癥為慢性病例的特征。巴氏桿菌病由于在很多動物中并沒有表現出血性敗血癥的特點，但是其他一些疾病卻有出血性敗血癥的特征。因此，為避免混淆，將其命名為多殺性巴氏桿菌更為合適。

牛傳染性胸膜肺炎的別名是牛傳染性支原體肺炎，俗稱牛肺疫，主要是由肺炎支原體感染引起的一種急性接觸性傳染病。該病的臨床癥狀明顯，病牛咳嗽、體溫升高，牛群的正常生長發育受到影響。感染該病的牛年齡大小不同，牛的致死率也略有不同。該病主要病理變化是纖維素性胸膜肺炎，病死率高、急性耐受的逐漸轉為慢性型的病牛，成為養殖場主要傳染源，是造成疾病反復流行和蔓延的主要原因。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

主要試劑有BHI培養基、革蘭氏染色液、DL2000核酸Marker。試驗儀器有200 μL移液器、培養皿、5 mL注射器。試驗動物為19～23 g健康巴貝斯小鼠6只。

1.2 臨床檢查及剖檢

通過常規的臨床檢查方法檢查病牛，并剖檢死亡牛只，然后逐一觀察每個臟器的病變情況并將有明顯病變的臟器進行摘取拍照，記錄其病變情況。

1.3 實驗室診斷

1.3.1 細菌的分離培養。在無菌條件下處理牛的肺臟病變組織，即首先將肺臟組織剪取部分涂抹于BHI固體培養基上，其次剪取另外一部分接種到BHI液體培養基上，最后將固體培養基放到37℃溫箱中培養24 h，將液體培養基放到37℃水平搖床上，在150 r/min條件下增菌培養24 h。

1.3.2 革蘭氏染色和鏡檢。從搖床上取出培養的菌液，觀察增菌培養是否成功，若有大量細菌長出便可用常規染色方法進行革蘭氏染色，染色完畢后鏡檢并觀察目的細菌的形態。固體培養基培養到一定時間后觀察，如果有菌落長出就選取疑似巴氏桿菌的菌落染色并鏡檢觀察其形態。最后挑取疑似巴氏桿菌的單菌落接種到液體培養基中，然后放到37℃水平搖床上培養 （150 r/min），24 h后取出菌液染色鏡檢，觀察細菌形態。此過程是將細菌進一步純化，使目的細菌更加容易被分離出來。

1.3.3 巴氏桿菌PCR檢測。將培養的細菌進行PCR檢測，引物為巴氏桿菌鑒定引物和巴氏桿菌a型鑒定引物；擴增體系為 25 μL，2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，引物各 1 μL，超純水補至 25 μL，混合后放到PCR擴增儀中。反應條件為94℃預變性5 min，94℃循環變性 30 s，56℃退火復性30 s，72℃延伸40 s，30個循環；72℃終延伸10 min，最后在4℃下保存。反應結束后，用瓊脂凝膠回收試劑盒將PCR產物回收后，送上海生工生物工程有限公司進行測序。

1.3.4 支原體病原PCR檢測。將牛的肺臟組織進行充分研磨，將其處理成組織懸液后參照DNA提取試劑盒說明書提取DNA。參照已報道的牛傳染性胸膜肺炎基因的保守序列及文獻[2]，用生物軟件DNAstar設計鑒定引物，進行PCR擴增，方法同上。

1.3.5 致病性試驗。將純化的菌液分別給4只健康小鼠的腹腔注射200 μL，對照組將生理鹽水分別給另外2只健康小鼠的腹腔注射200 μL，并隨時觀察試驗組和對照組小鼠的情況。

2 結果與分析

2.1 臨床癥狀及剖檢病變組織分析

該病發病急且快，病牛會表現出離群獨居的現象。剛發病時，病牛發燒至42℃，呼吸頻率加快，精神狀態萎靡，身體日漸消瘦，生長發育不好，被毛沒有光澤且比較凌亂是大多數病牛的狀態。隨著病情加重，患病牛停止進食，不規律反芻，有清鼻液流出，然后變稠。咳嗽1周以后，病牛病癥加重，開始出現干咳并伴有疼痛，腹部明顯起伏，頻頻顧腹，有氣喘的表現，氣管內可以聽到明顯的鼾聲。生病牛只流出鐵銹色鼻液，而且經常粘在鼻腔上面。解剖病牛后發現，病變主要集中在肺和胸膜。胸腔內積聚大量淡紅色或淡黃色纖維狀滲出液，數量有多有少。仔細觀察發現這些滲出液里有少量纖維網狀物質或有的貼附在肺臟組織的表面[3]。剖檢結果發現病死牛的肺組織表面有大小不一樣的明顯的膠體浸潤和肝臟病灶。病變肺組織腫大，質地堅硬，切面大理石狀是該病病死牛的典型特征。

2.2 革蘭氏染色及鏡檢結果分析

BHI固體培養基上的細菌生長狀況良好，有圓形、半透明狀、質地濕潤小菌落（圖1）長出。鏡檢可見球桿形狀，單個或者成對排列的革蘭氏陰性菌（圖2）。

2.3 PCR檢測結果分析

PCR 結果表明，在 492、980、512、510 bp 處均出現明亮條帶（圖3、4），與預期相符，說明牛支原體、牛莢膜血清A型多殺性巴氏桿菌均呈陽性。

2.4 致病性試驗結果分析

試驗組和對照組注射相應液體后8 h，試驗組小鼠開始行為呆滯，不喜進食，12 h后陸續死亡。對照組的小鼠正常進食和活動，且沒有死亡小鼠（圖5）。

3 結論與討論

牛傳染性胸膜肺炎的診斷和預防技術已經比較成熟。相關文獻研究表明，我國的中獸醫對該病的治療方法多種多樣，符合我國當今社會對綠色產品以及無公害養殖的追求。因此，該病的治療已經逐步實行中獸醫治療以及借助西醫準確診斷，中醫針對性對癥治療，中西醫結合，中醫調理治療病牛和西醫輔助治療方法等，使養殖生產的牛肉產品最大程度地滿足公眾的需求，有利于養殖戶進一步提高養殖效率。動物抵抗力是巴氏桿菌病發生的先決條件，任何會降低動物抵抗力的因素都會促進巴氏桿菌病的發生和流行。氣溫突降會使動物的抵抗力下降，多殺性巴氏桿菌會趁機侵入動物體內，通過淋巴結進入動物的血液從而形成動物菌血癥[4-5]。牛肺炎和牛惡性卡他熱易與該病的臨床癥狀相混淆[6]。該次病癥為傳染性胸膜肺炎和巴氏桿菌的混合感染，結合金映紅等[7]的研究可以看出牛羊感染肺炎不再僅僅是單一感染，而開始出現了混合感染現象，且診斷方式應以實驗室診斷為主，才能有更準確的診斷結果。

健康的牛身上一般會有支原體和巴氏桿菌生活，會導致牛在受到各種應激刺激（如斷奶、運輸、感冒、營養不良等）后發病。綜合來看，應遵循“管理為主、治療為輔、防治結合”的原則。當發現有發病跡象的牛時，首先應立即將所有病牛用具和使用場所隔離，并進行全面消毒；病牛痊愈或者癥狀減輕后，不用立即轉回健康牛所在的場所，終生飼養在治療圈內是最好的辦法；慢性感染或者癥狀較輕的牛只，會對外界進行長時間的排毒，從而感染健康牛，因而應對這些牛加強管理，不容忽視；孕牛和斷奶之前的小牛也要加強飼養管理。