進境百合種球上3種線蟲的檢疫鑒定研究

楊小鳳 祝秀麗 陸辰晨 邵沛澤 諶運清 趙光明 楊萬風 汪連軍 潘 杰

（連云港海關，江蘇連云港 222042）

近年來，我國花卉產業不斷發展壯大，百合、郁金香等廣受人們喜愛。江蘇口岸在全國花卉種苗進口方面占有舉足輕重的地位，其進境花卉種球主要來源于荷蘭，多為百合、郁金香、風信子和洋水仙等，品種繁多。花卉種球以活體形式進行貿易與運輸，為保持種球活性，進境時一般帶有根和栽培介質。線蟲分布廣泛，生存和繁殖能力非常強[1]，在種球及介質土中能夠長期存活并難以徹底清除。2020年，連云港口岸從進境百合種球中檢出多種線蟲，其中洞穴長尾線蟲（Seinura caverna）、毀芽滑刃線蟲（Aphelenchoides blastophthorus）和燕麥真滑刃線蟲（Aphelenchus avenae）為江蘇口岸首次截獲。本文主要對上述3種線蟲進行檢疫鑒定，以期為進境花卉種球檢疫監管提供參考。

1 材料與方法

1.1 線蟲分離

采用改良貝曼漏斗法，取約100 g剪碎的百合種球或介質土，用雙層紗布包裹，輕輕放入盛有水的漏斗中（避免液體渾濁），以水剛好浸透樣品為宜。25℃左右靜置24 h，用凹面皿接取線蟲液約10 mL，在ZEISS Discovery.V8體視顯微鏡下進行鏡檢。

1.2 形態學鑒定

在體視顯微鏡下挑取目標線蟲至載玻片，熱殺死后制成臨時玻片，在ZEISS Imager.A2顯微鏡下進行形態特征觀察及拍照。將線蟲液收集到離心管中，用4%甲醛殺死固定后，采用甘油－乙醇快速脫水法[2]對線蟲進行脫水并制作永久玻片，在顯微鏡下進行形態特征觀察及拍照，利用de Man公式進行形態測計[3]。 包括體長、體長/最大體寬（a）、體長/頭頂至食道腺和腸連接處距離（b）、體長/頭頂至食道腺末端距離（b′）、體長/尾長（c）、尾長/肛門處體寬或泄殖腔處體寬（c′）、頭頂至陰門處距離/體長（V）、口針長度、尾長和交合刺長度等指標。

1.3 分子生物學鑒定

挑取單條線蟲放入ddH2O中清洗，去除表面雜質。用單條線蟲DNA快速提取試劑盒（百川生物）提取線蟲基因組DNA，獲取DNA提取液直接進行PCR擴增。核糖體DNA（rDNA）的28S D2/D3區擴增引物對為 D2A（5′－ACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTG－3′）和 D3B（5′－TCGGAAGGAACCAGCTACTA－3′）[4]，由南京金斯瑞合成。PCR反應體系（25 μL）為線蟲DNA模板 1 μL、5 μmol/L 的上游引物和下游引物各 2 μL、2×Ex Taq Mix 12.5 μL、ddH2O 7.5 μL。 反應程序為94℃預變性 3 min，94℃變性 30 s，54℃退火 40 s，72℃延伸1 min，36個循環，72℃延伸8 min。將擴增產物送至南京思普金生物科技有限公司測序，所獲得拼接序列提交NCBI數據庫進行比對。

2 結果與分析

2.1 洞穴長尾線蟲

分類地位：真滑刃總科（Aphelenchoidea）滑刃科（Aphelenchoididae）長尾亞科（Seinurinae）長尾屬（Seinura）[5]。

2.1.1 形態特征描述。雌蟲形態特征如圖1所示：熱殺死后，洞穴長尾線蟲雌蟲向腹面彎曲，頭部較高，縊縮明顯，口針纖細，無口針基部球，基部稍膨大；食道前體部長筒形，中食道球發達，長橢圓形，近體寬，瓣門明顯，位于中食道球中后部；排泄孔位于中食道球基部前方；食道腺長葉狀，從背面覆蓋腸；陰門位于蟲體中后部，橫裂，陰道稍向前傾斜；單生殖腺，卵巢前伸，有后陰子宮囊；肛門明顯，尾部較長，絲狀。雄蟲未見。

測計值及文獻比較見表1。與Kanzaki等[6]的描述值相比較，本文雌蟲的體長及尾長均略短，分別為（746.1±19.9）μm（變化范圍為 726.0～772.1 μm）、（102.5±7.8）μm（變化范圍為 95.1～113.2 μm）；其他測計值基本相符。

表1 洞穴長尾線蟲測計值及文獻比較

2.1.2 分子生物學特征分析。PCR擴增獲得一條長度為756 bp的28S D2/D3區DNA序列。BLAST比對結果表明，該序列與GenBank中已登錄的S.caverna（LC414971）序列相似性達100%。

2.2 毀芽滑刃線蟲

分類地位：真滑刃總科（Aphelenchoidea）滑刃科（Aphelenchoididae）滑 刃 亞 科 （Aphelenchoidinae）滑刃屬（Aphelenchoides）[5]。

2.2.1 形態特征描述。如圖2所示：雌蟲熱殺死后向腹面彎曲，體表具環紋，側線4條；唇區縊縮明顯，唇區寬約為唇高2倍；口針長約13 μm，基部球明顯；中食道球卵圓形，肌肉組織發達，近體寬，瓣門骨化明顯，新月形；食道峽部短，神經環位于中食道球后約1個中食道球長度位置；食道腺葉狀，背面覆蓋腸端；單卵巢，前伸，卵母細胞單列，有后陰子宮囊，長度為肛陰距的1/2～2/3；陰門位于蟲體中后部，V值約為68%；尾圓錐形，尾長約為肛門處體寬的3倍，尾端具單尾尖突。雄蟲形態特征與雌蟲相似，但體長普遍比雌蟲短；交合刺呈玫瑰刺狀，具基頂和喙突；無引帶和交合傘；尾形與雌蟲相似，具單尾尖突。

測計值及文獻比較見表2和表3。與Consoli等[7]和Franklin等[8]的描述值相比較，本文雌蟲a值較小，為 25.4±0.9（變化范圍為 24.2～26.4），陰門位置略靠前，V 值為 67.9%±0.9%（變化范圍為 66.8%～69.0%），其他測計值基本相符。本文雄蟲體長略高于Consoli等[7]的描述值，低于Franklin等[8]的描述值，體長為（689.0±65.6）μm（變化范圍為 606.3～771.2 μm）；a值、口針及交合刺長度與Consoli等[7]的描述相似，均低于Franklin等[8]的描述值；其他測計值基本相符。

表2 毀芽滑刃線蟲雌蟲測計值及文獻比較

表3 毀芽滑刃線蟲雄蟲測計值及文獻比較

2.2.2 分子生物學特征分析。提取雌蟲DNA，PCR擴增獲得一條長度為733 bp的28S D2/D3區DNA序列，BLAST比對結果表明，該序列與GenBank中已登錄的A.blastophthorus（MK981894）序列相似性達98%。

2.3 燕麥真滑刃線蟲

分類地位：真滑刃總科（Aphelenchoidea）真滑刃科（Aphelenchidae）真滑刃亞科（Aphelenchinae）真滑刃屬（Aphelenchus）[5]。

2.3.1 形態特征描述。雌蟲形態特征如圖3所示：熱殺死后稍向腹面彎曲，頭部低平，口針較細，無基部球；中食道球大、近方形，直徑近體寬，食道球瓣門發達，食道峽部較短；食道腺葉狀，從背面覆蓋腸端；雌蟲陰門位置較后，陰門橫裂，陰門唇有時略突起，單生殖腺，卵巢前伸，后陰子宮囊長度超過肛陰距的1/2；肛門前唇略突起；尾短，稍向腹面彎曲，末端鈍圓或寬圓。雄蟲未見。測計值及文獻比較見表4，與Goodey等[9]和李星月等[10]的描述值相比較，本文雌蟲陰門位置略靠后，頭至陰門距離/體長V值為77.1%±1.6%（變化范圍為 74.6%～78.8%）；且尾長略短，尾長為（24.0±4.02）μm（變化范圍為 18.9～33.5 μm）；其他測計值基本相符。

表4 燕麥真滑刃線蟲雌蟲測計值及文獻比較

2.3.2 分子生物學特征分析。PCR擴增獲得一條長度為707 bp的28S D2/D3區DNA序列，BLAST比對結果表明，該序列與GenBank中已登錄的A.avenae（KP313838）序列同源性達98%。

3 結論與討論

隨著外來花卉種球進境的線蟲種類繁多，口岸人員關注檢疫性植物寄生線蟲的同時，也面臨著數量及種類更為龐大的非檢疫性線蟲檢疫，此類線蟲的潛在性危險不容忽視。因此，準確判斷線蟲種類，對提高口岸線蟲檢疫水平、加強口岸進境花卉種球風險分析至關重要。近年來，隨著實驗室檢測能力的提升，連云港口岸截獲線蟲種類及數量明顯上升，本文所描述3種線蟲均為江蘇口岸首次截獲。

長尾屬線蟲廣泛分布于世界各地，是一類食性較廣的捕食性線蟲，主要存在于土壤中，具有維持土壤線蟲種群動態平衡的作用，在枯死的松樹中也常被發現[11]。長尾線蟲屬是一類形態學研究還不太完善的類群，在迄今已報道的44個有效種中，絕大部分種類仍然存在特征描述不完善的問題[12]。洞穴長尾線蟲（S.caverna）在連云港口岸進境百合種球檢疫中多次截獲，主要存在于百合種球隨附的介質土中，國內現有報道對洞穴長尾線蟲的研究較少，其形態特征描述有待完善，有無致病性也有待進一步研究。

我國對外公布的《中華人民共和國進境植物檢疫性有害生物名錄》中，滑刃屬線蟲只有草莓滑刃線蟲（Aphelenchoides fragariae）、菊花滑刃線蟲（Aphelenchoides ritzemabosi）。 毀芽滑刃線蟲（A.blastophthorus）最早在英國發現，國內現有報道較少。有研究表明，毀芽滑刃線蟲能夠引起山蘿卜屬植物葉片卷曲、花序減少，對草莓也具有潛在破壞力[8]。因此，在進境線蟲檢疫中應給予足夠重視。

燕麥真滑刃線蟲（A.avenae）在世界各地均有分布，美國、法國、中國、意大利、印度、加拿大、菲律賓等國都有報道，是一類食真菌線蟲，也可取食植物，寄主范圍十分廣泛[13]。有研究表明，燕麥真滑刃線蟲對土壤氮礦化、植物生長及真菌生長有影響，但其作用與土壤生態系統存在復雜的相互關系[14]。燕麥真滑刃線蟲在進境百合種球檢疫中頻繁截獲，對種球生長有無不利影響有待進一步研究。