寧夏雞傳染性支氣管炎病原學檢測及N 基因序列分析

閔 澤，周海寧，馬 龍，尹 才，馬 林，魏凡華，李知新

（1.寧夏大學農(nóng)學院，寧夏銀川 750021；2.寧夏回族自治區(qū)動物疾病預防控制中心，寧夏銀川 750011）

雞傳染性支氣管炎（infectious bronchitis，IB）是由雞傳染性支氣管炎病毒（infectious bronchitis virus，IBV）引起的一種急性、高度接觸性的傳染病。IB 在世界廣泛流行，是導致養(yǎng)禽業(yè)經(jīng)濟損失的重要病因之一[1]。IBV 最初只導致感染雞群出現(xiàn)呼吸道癥狀，隨著病情發(fā)展，將侵害蛋雞的生殖系統(tǒng)，致使蛋質(zhì)量下降。其中，腎型IB 主要侵害雛雞的腎臟，引起腎臟病變，導致雛雞死亡[2]。我國從1977 年開始對該病進行研究，各地區(qū)相繼分離出了IBV 毒株。IBV 流行毒株基因型復雜[3]，主要為QX、4/91、TW、Mass 型，其中QX型是優(yōu)勢基因型[4]。

IBV 基因組全長約27.6 kb，核酸為單股正鏈RNA，編碼4 種結(jié)構(gòu)蛋白，分別為核蛋白（N）、纖突蛋白（S）、膜蛋白（M）及小膜蛋白（E）。N 蛋白上存在抗原決定簇，具有免疫識別位點，是IBV 重要的免疫原，對機體產(chǎn)生體液免疫發(fā)揮著關鍵作用[5]。同時N 蛋白編碼基因是IBV 基因組中的保守結(jié)構(gòu)域，不易發(fā)生突變，在病毒復制、轉(zhuǎn)錄時處于關鍵位置[6]，但其突變會改變保護性。因此，分析分離株的N 蛋白編碼基因，有助于了解病毒在當?shù)氐牧餍汹厔莺瓦z傳演化規(guī)律。

近年來，寧夏報告了多起IB 疫情，嚴重影響了當?shù)仞B(yǎng)禽業(yè)發(fā)展。為摸清IB 流行狀況和IBV 優(yōu)勢基因型，采集雞咽喉/泄殖腔拭子開展了研究，以期為寧夏IB 疫情防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 2021 年9—11 月，在寧夏利通區(qū)、中寧縣、沙坡頭區(qū)、惠農(nóng)區(qū)、大武口區(qū)、隆德縣、原州區(qū)、西吉縣等8 個縣（區(qū)）的8 個規(guī)模化養(yǎng)殖場和3 個散養(yǎng)戶，按不同飼養(yǎng)場舍劃分采樣群體，每個場舍采集日齡相同的蛋雞咽喉/泄殖腔拭子共646 份，-80 ℃保存。

1.1.2 主要儀器 核酸提取儀，B24NP968-S 型，西安天隆公司產(chǎn)品；紫外凝膠成像儀，univeral hood II，美國伯樂公司產(chǎn)品；基因擴增儀，PCT200 型，美國伯樂公司產(chǎn)品；電泳儀，DYY-2C 型，電泳槽，DYYCP-31C 型，均為北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品；高速冷凍離心機，5424型，德國艾本德公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要試劑 磁珠法病毒RNA 提取試劑盒，購自西安天隆公司；DL 2 000 DNA Maker和PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2（Dye Plus），均購自寶日醫(yī)生物技術（北京）有限公司（TaKaRa）；SPF 雞胚，購自山東浩泰畜禽養(yǎng)殖基地。

1.2 方法

1.2.1 病毒分離培養(yǎng) 將樣品置于預先加入含有青霉素（10 000 U/mL）及鏈霉素（10 000 μg/mL）的1 mL PBS 緩沖液的離心管中，振蕩2 min，8 000 r/min 離心2 min，取上清液收集到離心管中；將已孵育9～10 d 的SPF 雞胚，用碘伏和酒精依次消毒后，鉆孔接種病毒，72 h 后收集全部尿囊液，用含有10 000 U/mL 的青霉素和10 000 μg/mL 鏈霉素的PBS 緩沖液稀釋5～10 倍，按此方法盲傳3～5 代。

1.2.2 引物合成 根據(jù)文獻[7]設計合成一對引物，預期片段大小為409 bp。引物序列見表1。

表1 參考引物序列

1.2.3 RT-PCR 檢測 選擇盲傳至第4 代的明顯出現(xiàn)矮小化等典型IB 癥狀的雞胚，收集尿囊液，按照GB/T 23197—2008 中的方法，將尿囊液稀釋后作為待檢材料。使用磁珠法病毒RNA 提取試劑盒進行核酸提取。反應體系：PrimeScript One Step Enzyme Mix 1.0 μL、2×One Step Buffer（Dye Plus）12.5 μL、模板 1.0 μL、Forward primer 1.0 μL、Reverse primer 1.0 μL、RNaseFree H2O 8.5 μL，反應總體積25.0 μL。擴增產(chǎn)物用1%凝膠電泳進行鑒定。將電泳條帶約為409 bp 大小的擴增產(chǎn)物送至華大基因公司進行測序。

RT-PCR 擴增參考程序：50 ℃ 30 min，94 ℃2 min；94 ℃ 30 s，50.5 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30 個循環(huán)；72 ℃ 10 min。擴增產(chǎn)物4 ℃待檢。

1.3 分離毒株序列分析

分離株N基因測序后，與NCBI 數(shù)據(jù)庫中29株我國和其他國家早期分離的IBV 毒株N基因序列進行比對，利用MEGA7.0 軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育進化樹。主要參考毒株見表2。

表2 參考毒株序列

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR 檢測

646 份雞咽喉/泄殖腔拭子，經(jīng)RT-PCR 擴增和電泳，發(fā)現(xiàn)88 份樣品呈現(xiàn)單一清晰條帶，大小約409 bp，與預期條帶相符，確定為IBV 陽性，總陽性率為13.62%。部分樣品檢測結(jié)果見圖1。

不同地區(qū)和養(yǎng)殖類型統(tǒng)計結(jié)果（表3）顯示：西吉縣陽性率最高，為36.00%，其次是利通區(qū)，陽性率為32.29%，其他縣區(qū)陽性率較低；規(guī)模化養(yǎng)殖場陽性率普遍高于散養(yǎng)戶。

表3 寧夏8 個縣（區(qū)）雞咽喉/泄殖腔拭子樣品檢測結(jié)果

2.2 N 基因遺傳進化分析

本試驗成功分離到1 株IBV 毒株（NXIBV）。遺傳進化分析結(jié)果（圖2）顯示，除Ark99 株較為獨立外，分離株與其他參考毒株形成了3組進化群，處于第Ⅲ進化群（QX 型），與我國山東SDIB702/2012 株、SDIB778/2012 株及SDIB662/2011 株的親緣關系最近，同源性分別為97.55%、97.29%、97.28%，與韓國K047-12 株同源性為97.01%；與我國優(yōu)勢毒株QX 型代表株（KM586818）同源性較高，為93.31%，與TW、4/91、TC07-2 等的同源性為85.60%～89.67%；與我國常用的疫苗血清型H120（AY028296）、M41（DQ834384）毒株同源性分別為86.67%和86.14%。

3 討論

IB 嚴重威脅著我國養(yǎng)雞業(yè)。臨床中，腎型IB最為常見[8]，導致的雛雞死亡率可達30%以上，剖檢可見腎臟出現(xiàn)大量尿酸鹽沉積，伴隨出血，呈花斑狀[9]。本試驗對部分癥狀明顯的病死雞進行病理解剖，發(fā)現(xiàn)與腎型IB 病變較為一致。本次試驗發(fā)現(xiàn)，70 日齡左右的蛋雞陽性率最高，說明IBV更易感染較小日齡蛋雞。

董志華等[10]報道，2009—2017 年廣西IB 平均陽性率為11.5%；丘旭龍等[11]報道，河南省2010—2011 年IB 最高陽性率為15%。江蘇、山東、四川等省份在2008—2020 年進行過IB 流行病學調(diào)查，發(fā)現(xiàn)該病一年四季均可發(fā)生，但在秋季和冬季檢出率較高，發(fā)病率為11%～15%[10-16]。本試驗發(fā)現(xiàn)，寧夏地區(qū)蛋雞群的IBV 總體陽性率為13.62%，與國內(nèi)其他省份近十年狀況基本相同。

基因分析結(jié)果表明，本試驗分離株與29 株參考毒株的N基因序列形成了3 個較大的分支，而分離毒株處于第Ⅲ分支（QX 型），與SDIB702/2012株親緣關系最近，同源性為97.55%，與我國QX代表株P100 同源性為93.31%。此外，該分離株與韓國SNU-11045 株、SNU-8065 株親緣關系較近，而這兩株毒株均為2005 年分離的QX 腎型毒株[17]。因此，可以確定本試驗分離株為我國優(yōu)勢基因型QX 型。廣西、山西、山東、江蘇等地在2008—2020 年多次對分離出的本地毒株進行基因分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)本地流行毒株70%以上為QX型[10-11，13-14]，說明在寧夏流行的優(yōu)勢IBV 基因型與我國其他多個省份流行的優(yōu)勢基因型相同。目前我國常使用的疫苗血清型有H120、H52 及H41 型，都屬于Mass 基因型[18]。Mass 型是我國目前運用最廣泛、效果最好的疫苗基因型，但與寧夏分離株同源性較低，由此推測我國常用的Mass 型疫苗對本試驗分離株難以產(chǎn)生有效的免疫保護作用，這可能是導致疫情發(fā)生的主要原因。

綜上建議：繼續(xù)進行IBV 流行病學監(jiān)測，對外來引進雞群要做好引種檢疫工作，防止外來病原入侵；在此病高發(fā)的秋冬季節(jié)，更要重視對該病的防控；針對本地疫情流行狀況，及時使用高效疫苗進行預防，從而減少養(yǎng)雞戶經(jīng)濟損失。

致謝：

本研究得到了寧夏動物疾病預防控制中心王曉亮研究員和南京農(nóng)業(yè)大學在讀博士生程肖曄、左冉坤的幫助。