雙向電泳指紋圖譜分析法鑒別鮮乳和復(fù)原乳

王海艷，李 昕，石新華，蒙 嶸，李鳳利，張小玲，盛萬里

（1.呼和浩特海關(guān)，內(nèi)蒙古呼和浩特 010020；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)技術(shù)推廣中心，內(nèi)蒙古呼和浩特 010010）

復(fù)原乳是將無水奶粉和水混合加工處理后制成的液體乳，其成分因多次高溫處理而受到破壞，導(dǎo)致部分蛋白、生物活性成分和免疫因子消失，因此可以基于這些特點(diǎn)，利用區(qū)分蛋白的技術(shù)手段，將復(fù)原乳與鮮乳區(qū)分開來。雙向電泳技術(shù)（2DGE）是目前分辨率最高、唯一可同時(shí)分離上千種蛋白質(zhì)的方法。該技術(shù)利用蛋白質(zhì)等電點(diǎn)和相對(duì)分子質(zhì)量的不同分離蛋白質(zhì)：首先依據(jù)等電點(diǎn)不同，將不同凈電荷的蛋白質(zhì)進(jìn)行分離，然后再依據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量的不同通過SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳將不同蛋白點(diǎn)進(jìn)行分離。因此，2DGE 是一種宏觀、可量化的技術(shù)手段，具有分辨能力強(qiáng)、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，被廣大科研工作者用于科學(xué)研究[1]。該技術(shù)過去曾用于中藥材真?zhèn)舞b別[2]，并得到美國食品藥品管理局和世界衛(wèi)生組織的認(rèn)可[3-4]。近年來，我國也將該方法應(yīng)用于食品過敏原研究并取得滿意結(jié)果[5-6]。本研究探討采用2DGE 對(duì)鮮乳和復(fù)原乳進(jìn)行真?zhèn)舞b別的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 乳及乳粉樣本 鮮乳，采集于內(nèi)蒙古呼和浩特市郊區(qū)某奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)；巴氏乳、乳粉以及巴氏處理的復(fù)原乳，購于某大型超市。

1.1.2 主要試劑 7 cm、17 cm ReadyStrip（pH3.0～10.0、3.9～5.1、4.0～7.0、4.7～5.9、5.5～6.7）膠條，IPG 緩沖液（pH3.0～10.0、3.9～5.1、4.0～7.0、4.7～5.9、5.5～6.7），2DGE 相關(guān)試劑，購自美國BIO-RAD 公司；BCA Protein Assay kit 蛋白定量試劑盒，購自美國Novagen 公司。

1.1.3 主要設(shè)備 2DGE 系統(tǒng)和蛋白掃描儀，購自美國BIO-RAD 公司。

1.2 方法

1.2.1 牛乳樣品雙向電泳條件選擇 將原乳樣品常溫下1 500g離心20 min 后，去除上層脂肪，測(cè)定蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度后備用；按照2DGE 系統(tǒng)和膠條使用說明書進(jìn)行第一向和第二向電泳，電泳結(jié)束后先用考馬斯亮藍(lán)染色，再用蛋白掃描儀掃描圖像。

1.2.1.1 第一向等電聚焦 取出冷凍保存的水化上樣緩沖液1 mL 置室溫溶解，在管中加入0.01 g DTT 和5 μL Bio-Lyte 后混勻，然后各取500 μL 分別加入4、6、8、10 μL 乳樣并混勻；取出冷凍保存的不同pH 的7 cm 和17 cm IPG 預(yù)制膠條，置室溫10 min，沿水化盤中槽的邊緣從左至右加入樣品，再將IPG 膠條膠面朝下置于水化盤中樣品溶液上；在每根膠條上覆蓋2 mL 礦物油；蓋上蓋子，按等電聚焦程序進(jìn)行分離。等電聚焦后立即進(jìn)行平衡和第二向SDS-PAGE 電泳，如果不能及時(shí)進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)，則置于-70 ℃冰箱保存。

1.2.1.2 第二向SDS-PAGE 電泳 配制10%的丙烯酰胺凝膠2 塊；從-20 ℃冰箱中取出膠條，于室溫放置10 min，使其溶解，按照操作說明書要求將膠條進(jìn)行平衡后將其浸在1×電泳緩沖液中，然后將膠條膠面朝上放在有凝膠的長玻璃板上；將放有膠條的SDS-PAGE 凝膠轉(zhuǎn)移到灌膠架上，在凝膠上方加入低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠液，用鑷子輕輕向下推膠條，使之與聚丙烯酰胺凝膠膠面完全接觸，待徹底凝固后進(jìn)行電泳；電泳結(jié)束后再進(jìn)行染色。

1.2.2 不同牛乳樣品雙向電泳比較 將采集于某奶牛場(chǎng)的新鮮乳去除上層脂肪自制成原乳、巴氏乳和超高溫瞬時(shí)滅菌乳（UHT 乳），將乳粉制成巴氏處理的復(fù)原乳。將這4 種樣品調(diào)整為總蛋白量基本一致，參照1.2.1 的方法電泳、染色和蛋白分析。

1.2.3 實(shí)際樣品檢測(cè) 采用pH4.7～5.9 的17 cm膠條，對(duì)市場(chǎng)上購買的巴氏乳以及巴氏處理的復(fù)原乳進(jìn)行電泳分析，方法同1.2.1。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛乳樣品雙向電泳條件選擇

以脫脂原乳為樣品，選擇不同pH 的7 cm 和17 cm 膠條進(jìn)行比較。結(jié)果（圖1）可見：牛乳的主要蛋白點(diǎn)都集中在pH4.0～7.0 范圍內(nèi)，pH4.7～5.9和pH4.0～7.0 的膠條等電聚焦后均能夠有效區(qū)分蛋白點(diǎn)，但是pH4.7～5.9 蛋白點(diǎn)最清晰，且17 cm 比7 cm的膠條蛋白點(diǎn)更清晰，比較適合牛乳蛋白電泳。

2.2 不同牛乳樣品2DGE 比較

將原乳、巴氏乳、UHT 乳、巴氏處理復(fù)原乳4 種樣品調(diào)整為總蛋白量基本一致后進(jìn)行2DGE 試驗(yàn)。結(jié)果（圖2）顯示：隨著熱處理強(qiáng)度的增加，蛋白點(diǎn)著色變淺。通過軟件分析，將參數(shù)設(shè)置為巴氏乳蛋白含量比復(fù)原乳高2 倍以上時(shí)，有10 個(gè)蛋白點(diǎn)滿足該條件（圖3）。

2.3 實(shí)際樣品檢測(cè)

為進(jìn)一步驗(yàn)證該鑒定技術(shù)的可行性，對(duì)市售的幾種巴氏乳和復(fù)原乳產(chǎn)品進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)巴氏乳圖譜與自制參照乳圖譜基本一致，而復(fù)原乳蛋白點(diǎn)明顯變少，著色變淡甚至模糊（圖4）。

3 討論

與鮮乳相比，復(fù)原乳的營養(yǎng)作用有所降低。國務(wù)院辦公廳在《關(guān)于加強(qiáng)液態(tài)乳生產(chǎn)經(jīng)營管理的通知》中明確要求，復(fù)原乳生產(chǎn)商必須在產(chǎn)品包裝上明確標(biāo)注“復(fù)原乳”字樣。但仍有部分復(fù)原乳生產(chǎn)企業(yè)未按要求進(jìn)行標(biāo)注，因此急需建立有效檢測(cè)方法開展市場(chǎng)監(jiān)管工作，以保證乳品市場(chǎng)健康發(fā)展。

2DGE 主要應(yīng)用于蛋白領(lǐng)域的研究工作，包括總蛋白、不同蛋白質(zhì)差異表達(dá)和蛋白修飾等，通過與標(biāo)準(zhǔn)蛋白比對(duì)，即可獲得檢測(cè)蛋白的等電點(diǎn)和相對(duì)分子質(zhì)量等相關(guān)信息，從而建立有效的數(shù)據(jù)庫。該技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。例如，通過斑點(diǎn)對(duì)比可檢測(cè)到差異蛋白，從而發(fā)現(xiàn)引起疾病的相關(guān)蛋白，并可查找到診斷疾病的相關(guān)標(biāo)記因子，也可通過查找與疾病相關(guān)的蛋白藥靶，用于疾病致病機(jī)理研究等[7]。

目前最常用的蛋白染色方法是考馬斯亮藍(lán)染色法和銀染法：考馬斯亮藍(lán)染色具有操作簡便、毒性低和重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛使用[8]，但其靈敏度低，導(dǎo)致低豐度蛋白難以顯現(xiàn)；銀染法是非放射性染色法中最靈敏的方法，但存在脫銀方法復(fù)雜、重復(fù)性差等缺點(diǎn)使其使用受限[9]。目前，有研究者正積極探索更適合區(qū)分乳中蛋白的染色方法，例如熒光染色、同位素標(biāo)記、負(fù)染法等。

本研究采用雙向電泳技術(shù)，對(duì)市場(chǎng)上購買的鮮乳以及復(fù)原乳進(jìn)行電泳分析，發(fā)現(xiàn)電泳圖譜與自制參照乳圖譜基本一致，可以查找到差異蛋白，是一種行之有效的區(qū)分鮮乳和復(fù)原乳的檢測(cè)方法，且該技術(shù)重現(xiàn)性好，可為乳品品質(zhì)研究提供方法補(bǔ)充，從而為下一步乳品市場(chǎng)監(jiān)管提供有力的技術(shù)支撐。