生物制品用輔料蔗糖中顆粒雜質體外補體激活研究

王玨，江穎，肖新月，楊銳，孫會敏

(1.中國食品藥品檢定研究院，北京 100050；2.上海市醫療器械化妝品審評核查中心，上海 200020)

藥用輔料蔗糖常用于生物制品的冷凍干燥配方中，是最常用且用量很大的保護劑。近年來，生物制品引發的免疫反應受到社會關注[1-3]，但現有的研究很少區分這種不良的免疫反應是制劑或是輔料本身引起。據報道，輔料中可能引入的顆粒雜質是產生免疫應答不良反應的風險因素之一[4-5]。

補體系統是機體抗感染的第一道防線，是固有免疫的重要組成部分，主要參與非特異性免疫，在感染早期能迅速通過經典途徑、旁路途徑或凝集素途徑被活化，作用過程中可產生攻膜復合物以及 C3a 和 C5a 等關鍵中間產物，具有溶解細胞作用、調理作用、炎癥介質作用、清除免疫復合物作用及免疫調節作用。非常低的補體濃度即可誘導強烈的免疫效應，并參與炎癥和過敏反應。其中，過敏毒素C3a和C5a兩種信號分子能夠引起血管擴張，調節細胞因子的產生，引起組胺的釋放和氧化爆發，并作為天然免疫細胞趨化的信號，影響促炎和過敏反應的程度，產生過敏反應性臨床表現。C4a的產生是補體通過經典或凝集素途徑激活的標志。Bb因子是B因子的可溶性副產物，也是補體通過旁路途徑活化的特異性標志物[6]。過敏反應、類過敏反應和增加(不希望的)抗體反應都可由補體激活引起。

巨噬細胞屬于單核-巨噬細胞系統，在機體組織中廣泛存在，是機體免疫防御、免疫自穩、免疫監視中的重要組成部分。在機體的獲得性免疫和先天性免疫中均有著至關重要的作用。本文通過建立體外巨噬細胞補體激活模型，對蔗糖中的顆粒雜質進行提取制備并進行粒徑分析，發現該微粒的粒徑為100～300 nm；顆粒雜質可促進C3a的產生，激活C5轉化酶，產生C5a；C4a和Bb含量相比空白對照均有增加，證明該微粒可通過經典途徑、甘露糖凝集素途徑或旁路途徑激活補體。不同廠家蔗糖的補體激活程度不同。

1 材料與試劑

1.1 儀器 納米顆粒跟蹤分析儀(Particle Metrix，ZetaView)；切向流超濾系統(PALL，Minimate EVO)；離心過濾器(Millipore，Amicon Ultra 15)；凍干機(北京博醫康實驗儀器有限公司，FD-1A-50)；CO2培養箱(Thermo Fisher，Forma 371)；倒置熒光顯微鏡(Olympus Corporation，IX53)；離心機(Thermo Fisher，Multifuge X3R)；酶標儀(Molecular Devices，SpectraMax M2e)。

1.2 材料和試劑 蔗糖：A公司(批號：40482A)，編號：Suc-1；B公司(批號：191105)，編號：Suc-2；C公司(批號：102420190601)，編號：Suc-3；D公司(批號：20200207)，編號：Suc-4。PBS緩沖液、1640培養液、胰蛋白酶-EDTA消化液(0.25%)均來自Gibco公司；Ficoll單個核細胞分離液(GE Healthcare)；去離子水；鱟試劑(50-0.005 EU·mL-1，Charles River)；細菌內毒素檢查用水(Charles River)；細菌內毒素標準品(9 000 EU·mL-1，中國食品藥品檢定研究院)；人補體片段3a(C3a)ELISA試劑盒；人補體片段4a(C4a)ELISA試劑盒；人補體片段5a(C5a)ELISA試劑盒；人補體片段Bb(CBb)ELISA試劑盒。

1.3 細胞 人骨髓來源巨噬細胞，購自武漢普諾賽生命科技有限公司，用Procell人骨髓來源巨噬細胞專用完全培養基，于37 ℃、5%CO2培養箱中培養。

2 方法

2.1 蔗糖中顆粒雜質的制備和粒徑測定

2.1.1 不溶性顆粒物的提取和制備 取蔗糖適量，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加去離子水溶解并稀釋至刻度，制得濃度為100 mg·mL-1的溶液。用切向流過濾系統進行濃縮，用針對超純水的滲濾去除蔗糖，直到達到15倍于樣本溶液體積的透析液。將透析液通過微孔濾膜濾過，以3 000 r·min-1的速率離心10 min進一步濃縮液[7]，標記為NPI溶液。另取去離子水100 mL同法處理，作為空白對照。

2.1.2 顆粒雜質粒徑測定 采用納米顆粒跟蹤分析儀測定粒徑及其分布。

2.2 細菌內毒素的檢測 取1支細菌內毒素國家標準品，加入細菌內毒素檢查用水1 mL，渦旋混勻15 min，得到9 000 EU·mL-1的內毒素標準溶液，將該溶液稀釋得0.5～1 000 EU·mL-1的系列標準品溶液。另取蔗糖樣品適量，加內毒素檢查用水稀釋得25 mg·mL-1的溶液，分別按5倍和10倍稀釋。取10倍稀釋液和0.125 EU·mL-1的內毒素標準溶液以1∶1混合，渦旋混合30 s得陽性對照溶液。參照《中國藥典》2020年版(四部)[8]通則1143方法1 凝膠法進行測定。

2.3 巨噬細胞補體激活體外模型探究蔗糖顆粒雜質的補體激活途徑

2.3.1 樣品溶液的配制 精密稱取蔗糖適量，以PBS為溶劑，制得濃度分別為1、0.1、0.01 mg·mL-1的樣品溶液。取提取制備的顆粒雜質溶液，過濾除菌，稀釋得到108、107、106個/mL 3個工作濃度的樣品溶液。

2.3.2 人骨髓來源巨噬細胞的培養 人骨髓來源巨噬細胞，以Procell人骨髓來源巨噬細胞專用完全培養基，于37 ℃、5% CO2培養箱中培養。

2.3.3 補體激活模型的建立 細胞培養24 h，狀態穩定后，加入100 μL不同工作濃度的各樣品溶液，設置3個復孔。12 h后收集上清，1 000 r·min-1離心20 min。將所獲上清液用于ELISA檢測含量。

2.3.4 ELISA法測定上清液中C3a、C4a、C5a、Bb含量 采用ELISA法測定培養上清液中的補體含量,操作步驟按C3a、C4a、C5a、Bb試劑盒說明書進行測定，用酶標儀讀取450 nm波長處吸光度值。

2.4 統計學方法 實驗結果均以平均值±標準差(mean±SD)表示，用IBM SPSS Statistics 25對數據進行分析，組間差異采用One-way ANOVA進行統計學分析，P≤0.05時認為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 樣品中細菌內毒素的檢測 細菌內毒素是革蘭陰性細菌的細胞壁成分，可引起發熱等炎癥表現，其主要成分為脂多糖(LPS)。LPS活化的巨噬細胞其補體釋放含量會增加。鱟試劑法對待測樣品的細菌內毒素含量檢測試驗結果表明，本試驗待測樣本中的細菌內毒素含量均低于0.005 EU·mg-1。即樣品中內毒素污染較小，可排除假陽性的可能，免疫應答是由于樣品本身的刺激而導致。

3.2 顆粒雜質的粒徑及其分布 對提取得到的蔗糖中雜質顆粒進行尺寸和數量的測定，結果見圖1。由圖1A可知不同廠家蔗糖中顆粒雜質的粒徑及其分布均有所差異，單位體積所含有的顆粒數不同，但總體來說，粒徑分布在80～300 nm之間。圖1B是制備的顆粒雜質的粒子成像圖，在納米顆粒跟蹤儀的測試下該顆粒可以直觀顯示并被追蹤。據文獻報道，該顆粒雜質由葡聚糖、灰分和芳香族著色劑組成，在糖精制過程中沒有完全去除[9]。

A.粒徑及其分布的比較圖；B.制備的顆粒雜質成像圖圖1 提取制備的顆粒雜質及不同廠家蔗糖中顆粒雜質的粒徑及其分布

3.3 補體激活途徑 已有研究表明一些納米顆粒可能誘導補體激活[10]，其活化的程度和機制取決于多種因素，包括納米粒子的大小、表面特征和形態[11-12]。由圖2可知，來自蔗糖的顆粒雜質可促進C3a的產生，C3a是C3蛋白被C3轉換酶復合體裂解后產生的一種過敏性毒素，隨后在補體末端途徑中達到頂峰：激活C5轉化酶，開始產生C5a。C4a和Bb含量相比空白對照均有一定程度的增加，因此該顆粒雜質能夠激活體外巨噬細胞補體系統，其途徑可能有經典途徑、甘露糖凝集素途徑或旁路途徑。

圖2 ELISA方法測定蔗糖中顆粒雜質激活各補體的含量在對不同廠家來源的蔗糖溶液

分別取濃度為0.01、0.1和1 mg·mL-1的不同廠家的蔗糖配制的溶液與巨噬細胞共孵育，用ELISA法測定上清液中C3a、C5a、Bb和C4a的含量，結果如圖3所示。與對照相比，不同廠家的蔗糖溶液均可以引起顯著的補體激活效應，其中A廠家的產Suc-1處理后的巨噬細胞產生了較高含量的C3a、C5a、Bb和C4a，這可能與其中顆粒雜質的粒徑較大有關。

圖3 不同廠家的蔗糖產品促進補體激活的比較

4 討論

蔗糖中存在的顆粒雜質粒徑約為80～300 nm之間，這部分顆粒有可能激活補體系統，存在免疫應答風險造成用藥安全隱患。為減少其中的納米顆粒雜質，生產者可通過使用小孔徑過濾器(例如0.02 μm)過濾除去納米顆粒雜質，也可改進生產工藝并制定相關的內控標準，對高風險給藥途徑用的蔗糖中納米顆粒雜質進行合理控制。