基于一測多評法測定白芍中6 種成分含量?

張生杰，王 麗，田志梅，曹雪芹，龐文娟

武威市藥品檢驗檢測中心，甘肅 武威 733000

白芍為毛茛科植物芍藥Paeonia lactifloraPall.的干燥根，具有平肝止痛，養血調經，斂陰止汗功效［1］。白芍含有多種生物活性物質，主要有苷類、萜類、黃酮類、鞣質類、揮發油類、酚類和糖類等化合物，含白芍中成藥處方600 個，涵蓋主治疾病165 種、主治證候159 種［2］，白芍藥材的市場需求量較大，導致目前多個地方開始引種芍藥，關于所引種栽培白芍藥材質量如何，與其主產地白芍藥材質量是否一致尚未見研究報道，因此建立一種簡單、快速的白芍多指標質量控制方法尤為重要。

一測多評法（quantitative analysis of multi-components by single-marker，QAMS）由王智民課題組首次提出［3］，通過建立樣品中某一有效、廉價、易得的典型成分與樣品其余成分間的相對校正因子以計算樣品中其他成分的量。王智民等［4］建立的《一測多評質量評價技術指南》，被認為是適合中藥特點的多指標質量控制與評價模式，目前已廣泛應用于藥品質量控制領域［5-8］，一測多評法是中國藥典2015 版中重點推廣的技術之一，也是未來中藥多組分同步檢測的發展方向之一［9］，同時“一測多評”也將為中藥檢測方法的“綠色化”提供更有效的技術手段和途徑［10］。因此，本研究主要以甘肅河西地區引種白芍和主產區（安徽亳州、浙江磐安、四川中江、山東菏澤）白芍為研究對象，采用高效液相色譜法建立QAMS 分析方法，同時測定沒食子酸、兒茶素、芍藥苷內酯、芍藥苷、1，2，3，4，6-五沒食子酰基葡萄糖、苯甲酰芍藥苷6 種成分的含量，以芍藥苷為內參物，建立芍藥苷與其他5 種成分的相對校正因子，同時考察多個因素的耐用性及系統適用性，并測定不同產地白芍飲片，其結果與外標法測定結果進行t檢驗，以驗證所建QAMS方法的準確性和可行性。

1 材料

1.1 儀器LC-20AD 高效液相色譜配有DAD 檢測器（日本島津公司）；Agilent1260 與Agilent1100高效液相色譜（美國安捷倫公司）；MS105DU 十萬分之一電子分析天平（梅特勒托利多）；UA10MFD超聲波清洗器（德國wiggens）。

1.2 試藥共收集25 批白芍樣品，其中包括來自4 個主產地的20 批白芍樣品，5 個甘肅河西地區引種的白芍樣品。對照品沒食子酸（批號：110831-201906，含量以91.5%計）、兒茶素（批號：110877-201604，含量以99.2%計）、芍藥苷內酯（批號：190027-201902，含量以98.0%計）、芍藥苷（批號：110736-201943，含量以95.1%計）購于中國食品藥品檢定研究院；1，2，3，4，6-五沒食子酰基葡萄糖（批號：230031-201909，含量以98.0%計）、苯甲酰芍藥苷（批號：02003-201902，含量以98.0%計）購于北京更新生物科技有限公司；乙腈（色譜純，默克Merck 公司、批號：10945730812），其他試劑均為分析純。

統計研究乳腺腫塊患者中，良性腫塊血流顯示率66.7%（16/24），Vmax 為（11.40±6.35）cm/s，RI 為（0.55±0.11）；惡性腫塊血流顯示率為95.7%（44/46），Vmax 為（16.25±10.25）cm/s，RI 為（0.66±0.12），對比兩組腫塊血流顯示率、Vmax、RI差異顯著，有統計學意義（P＜0.05）。

2 方法與結果

2.1 混合對照品溶液制備取對照品沒食子酸、兒茶素、芍藥苷內酯、芍藥苷、1，2，3，4，6-五沒食子酰基葡萄糖、苯甲酰芍藥苷對照品適量，用甲醇配成含沒食子酸105.31mg/L、兒茶素115.43mg/L、芍藥苷內酯403.12 mg/L、芍藥苷997.35 mg/L、1，2，3，4，6-五沒食子酰基葡萄糖303.54 mg/L、苯甲酰芍藥苷107.35 mg/L的混合對照品溶液。

為了能夠讓農場主自行存儲農作物，讓農產品的價格維持在一個較為穩定的狀態，美國政府推出了儲備補貼制度。該制度主要指農場主通過與農產品信貸公司簽訂儲備合同，在農產品存儲期間，不僅可以獲得高于無追索權貸款率的貸款，而且能夠獲得一定的儲備補貼。但是當農產品被儲存之后，農場主不能私自隨意進行出售，必須在市場價格達到設定的釋放價格數值時才能夠將其售出[6]。如果達到釋放價格后農場主不愿意出售，那么政府將取消相應的利息補貼和儲備補貼；如果作物價格已經達到制定的收回貸款價格時，此時相關農作物貸款人必須歸還所貸款項。

2.6 真菌對抗菌藥物的敏感性 培養出白色念珠菌292株，占分離細菌株的11.50%。對氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、兩性霉素B、5-氟胞嘧啶均敏感。

精密取混合對照品儲備液，稀釋5、10、15、20、25 倍分別進樣10 μL，測定沒食子酸、兒茶素、芍藥苷內酯、芍藥苷、1，2，3，4，6-五沒食子酰基葡萄糖、苯甲酰芍藥苷的峰面積，以芍藥苷為內參物，分別計算沒食子酸（A）、兒茶素（B）、芍藥苷內酯（C）、1，2，3，4，6-五沒食子酰基葡萄糖（D）、苯甲酰芍藥苷（E）相對于芍藥苷（S）的相對校正因子fA/S、fB/S、fC/S、fD/S、fE/S。各成分相對校正因子的相對誤差（RSD）分別為0.33%、0.20%、0.32%、0.12%、0.12%，均小于0.5%，表明方法有效。見表2。

2.3 色譜條件色譜柱：Shim-pack GIST-HP C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）。流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫：0～10.0 min，95%～90% B；10.0～20.0 min，90%～80% B；20.0～30.0 min，80%～70%B；30.0～35.0 min，70%B；35.0～37.0 min，70%～50%B；37.0～50.0 min，50%B。檢測波長：232 nm，體積流量：1.0 mL/min，柱溫：30℃，進樣量：20 μL。

2.4.3 精密度試驗 稱取甘肅省金昌朱王堡引種栽培白芍樣品約1.0g，按照“2.2”項下方法制備供試品溶液，以“2.3”項下色譜條件連續進樣5次，測定峰面積。沒食子酸、兒茶素、芍藥苷內酯、芍藥苷、1，2，3，4，6-五沒食子酰基葡萄糖、苯甲酰芍藥苷峰面積的RSD 分別為0.69%、0.29%、0.70%、0.16%、0.36%、0.81%，表明儀器精密度良好。

我國出口企業勞動力成本和稅收高于周邊一些發展中國家，人民幣升值對我國出口企業的影響較大，導致小微出口企業的融資成本居高不下。應加快完善支持外貿發展的財稅金融政策，降低出口企業的融資成本，為降低出口商品的成本助力，使中國制造在國際市場上更有價格競爭力。

2.6.5 不同pH 值對校正因子的影響 取混合對照品溶液，按“2.3”項下色譜條件調整流動相磷酸水體積分數為0.01%、0.05%、0.10%，其他色譜條件不變，記錄峰面積，按“2.5”項下方法計算相對校正因子，結果RSD值均小于2.0%，表明各成分相對校正因子在磷酸水體積分數0.01%～0.10%范圍內耐受性良好。見表7。

圖1 色譜圖

2.4.2 線性關系考察 精密取混合對照品溶液，依次用甲醇溶液稀釋20、10、5、2倍，并與對照品溶液組成一系列混合對照品溶液，按“2.3”項下色譜條件分別進樣測定，以峰面積（Y）為縱坐標，質量濃度（X）為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程。見表1。

表1 6個化合物峰面積與濃度線性關系

2.4 HPLC方法學考察

就餐區域、購物區域以及商品展示區是目前商場的主要組成，個性化針對的是展示區設計進行的創新。該區域的構造、燈光色彩等可保留原來設計的精華，在此基礎上進行相應優化，使展覽的商品更加個性，增加其賣點。每個陳列架的設計要和商品相得益彰，最大程度地凸顯商品特色。例如在服裝展示區，男裝和女裝在展架設計上存在明顯差異，前者需要設計高端、奢華的衣櫥，并在燈光的烘托下，將服裝精細的做工、優質的面料展現在消費者面前。后者設計時需要相對寬敞的空間，將款式不同的衣服陳列在相應區域，給消費者造成視覺沖擊，使其感覺服裝款式新穎多樣。

2.4.5 重復性試驗 稱取甘肅省金昌朱王堡引種栽培白芍樣品6 份，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，測定各成分含量。結果沒食子酸、兒茶素、芍藥苷內酯、芍藥苷、1，2，3，4，6-五沒食子酰基葡萄糖、苯甲酰芍藥苷含量平均值分別為0.83、0.82、4.65、28.66、4.26、0.88 mg/g，RSD 分別為1.47%、1.27%、1.02%、0.85%、0.74%、0.92%，表示該方法重復性較好。

2.6.1 不同儀器對相對校正因子的影響 取混合對照品溶液，用Shim-pack GIST-HP C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）考察LC-20AT 型、Agilent1260型、Agilent1100型3種高效液相色譜系統，按“2.3”項下色譜條件，各進樣5、10、15、20、25 μL，記錄峰面積，按“2.5”項下方法計算相對校正因子，結果RSD值均小于2.0%，表明不同儀器型號對相對校正因子影響不明顯。見表3。

2.5 相對校正因子的建立校正因子計算。在一定線性范圍內，某一組分的量與檢測器響應值成正比，在進行多指標評價時，以樣品中某一代表組分為內標物，建立該組分與其他組分之間的校正因子（relative correction factor，RCF），通過相對校正因子計算其他組分的含量［4］：

式中fsi為內標物s 與組分i 之間的校正因子（f），AS為內參物S 峰面積，CS為內參物濃度，Ai為某待測成分i峰面積，Ci為某待測成分i濃度。

2.2 供試品溶液制備取白芍細粉1.0 g，精密稱定，置150 mL 三角瓶中，加入70%乙醇約50 mL，稱定重量，超聲（300 W，50 kHz）處理30 min，放冷，再稱定重量，70%乙醇補足，搖勻，0.22 μm 微孔濾膜濾過，即得。

2.4.4 穩定性試驗 稱取甘肅省金昌朱王堡引種栽培白芍樣品約1.0g，按照“2.2”項下方法制備供試品溶液，分別于2、4、8、10、12、24 h按“2.3”項下色譜條件測定峰面積。結果供試品溶液在24 h 內色譜峰面積無明顯變化，沒食子酸、兒茶素、芍藥苷內酯、芍藥苷、1，2，3，4，6-五沒食子酰基葡萄糖、苯甲酰芍藥苷的RSD 分別為0.59%、0.26%、0.11%、0.25%、0.97%、0.27%，表明供試品溶液在制備后24 h內穩定性良好。

表2 相對校正因子

2.6 相對校正因子的耐用性

閱讀和寫作是“辯證互補的關系”，在平時的語文教學中，我們要充分利用好教材這個“例子”，把閱讀教學和寫作教學有機結合起來，相互促進，共同提高。在學習人教版語文教材必修1第二單元的古代記敘散文時，我們既要積累相關的文言基礎知識、學習古代記敘散文的閱讀方法，也要注意學習這些課文在寫人記事等方面的寫作技巧，通過滲透、整合等方式把寫作教學和古文閱讀教學有機地結合起來，相互促進，提高學生的閱讀和寫作水平。

2.4.6 加樣回收率試驗 取已知含量的白芍樣品（杭州-1）9 份，每份約1.0 g，精密稱定，分成3組分別精密加入混合對照品儲備液3、5、7 mL，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.3”項下色譜條件下進樣，記錄色譜峰峰面積，沒食子酸、兒茶素、芍藥苷內酯、芍藥苷、1，2，3，4，6-五沒食子酰基葡萄糖、苯甲酰芍藥苷的平均加樣回收率分別為99.0% 、99.4%、98.6%、99.4%、99.3%、99.0%，RSD分別為1.08%、0.80%、1.27%、1.24%、0.90%、0.76%。

表3 不同儀器測定的相對校正因子（n=3）

2.6.2 不同色譜柱對相對校正因子的影響 取混合對照品溶液，采用LC-20AT 型高效液相色譜系統，考察色譜柱CAPCELL PAK-C18MGⅡ（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）、Shim-pack GIST-HP C18（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）、Agilent XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）、Phenomenex C18（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）4 種不同品牌和型號色譜柱，按“2.3”項下色譜條件分別進樣5、10、20 μL，記錄峰面積，按“2.5”項下方法計算相對校正因子，結果RSD 值均小于2.0%，表明不同色譜柱對各相對校正因子無明顯影響。見表4。

表4 不同色譜柱測定的相對校正因子（n=3）

2.6.3 不同柱溫對相對校正因子的影響 取混合對照品溶液，采用LC-20AT型高效液相色譜系統和Shim-pack GIST-HP C18（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）色譜柱，考察色譜柱不同柱溫25、30、35℃對相對校正因子的影響，結果RSD值均小于2.0%，表明相對校因子在柱溫25～35℃的耐受性良好。見表5。

國內齒圈熱處理主要應用高頻感應淬火工藝，但是因感應器的結構會帶來不同的淬硬效果。通常齒圈上下兩端面的淬硬層深度相同，即兩端面的淬硬層硬度也相同，硬度高了就會產生齒心部脆易斷裂的缺陷，大大降低齒的耐用性。在齒圈的實際工作時，僅僅與嚙合齒輪接近的端面受較大的沖擊，而與飛輪連接貼合的端面應該保持較軟具有緩沖的功用最佳。這樣歸結起來就是齒面硬、齒心部相對較軟才是最佳的齒圈淬火狀態，倒梯形結構的淬火感應器可以達到這個“外硬內軟”的理想狀態。

表5 不同柱溫下測定的相對校正因子（n=3）

2.6.4 不同流速對相對校正因子的影響 取混合對照品溶液，采用LC-20AT 型高效液相色譜系統和Shim-pack GIST-HP C18（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）色譜柱，考察色譜柱不同流速0.8、1.0、1.2 mL/min 對相對校正因子的影響，結果RSD 值均小于2.0%，表明（1.0±0.2）mL/min 的流速波動對相對校正因子無顯著影響。見表6。

表6 不同流速下測定的相對校正因子（n=3）

2.4.1 專屬性考察 取沒食子酸、兒茶素、芍藥苷內酯、芍藥苷、1，2，3，4，6-五沒食子酰基葡萄糖及苯甲酰芍藥苷對照品溶液、混合對照品溶液、供試品溶液，按照“2.3”項下色譜條件進行測定，分別采集6 種成分的光譜圖，通過DAD 檢測器采集3D 譜圖，比對樣品中各測定成分與相應對照品的光譜圖，結果供試品中各待測成分光譜圖相似度均＞0.99，色譜峰分離度均＞1.5，其他雜質峰對待測成分均無干擾。見圖1。

表7 不同pH下測定的相對校正因子（n=3）

2.6.6 不同實驗人員對校正因子的影響 取混合對照品溶液，3 位不同實驗員按“2.3”項下色譜條件測定，記錄峰面積，按“2.5”項下方法計算相對校正因子，結果RSD值均小于2.0%，表明不同實驗人員對相對校正因子影響不大。見表8。

表8 不同實驗員測定的相對校正因子（n=3）

2.6.7 相對校正因子的確定 將上述各實驗獲得的fsi值取平均值，最終確定沒食子酸（A）、兒茶素（B）、芍藥苷內酯（C）、1，2，3，4，6-五沒食子酰基葡萄糖（D）、苯甲酰芍藥苷（E）相對于芍藥苷（S）的相對校正因子分別為fA/S=0.699、fB/S=0.548、fC/S=1.470、fD/S=0.709、fE/S=0.656，RSD 分 別 為0.38%、0.38%、0.28%、0.62%、0.16%。

2.7 待測成分色譜峰定位采用待測組分（a）與內標物（s）的相對保留時間比值（ra/s=ta/ts）或保留時間差（ΔtR-AS=ta-ts）進行定位［4］。分別考察相對保留時間比值和保留時間差2 種參數在不同品牌儀器、不同規格色譜柱中的重現性，結果采用相對保留時間進行峰的定位較保留時間差的定位更可靠。見表9。

表9 不同儀器不同色譜柱下測得的相對保留值和保留時間差

2.8 QAMS 法與外標法測定結果的比較取四大主產和甘肅栽培白芍樣品25 批，按“2.2”項下制備樣品溶液，按“2.3”項下色譜條件分別測定樣品中沒食子酸、兒茶素、芍藥苷內酯、芍藥苷、1，2，3，4，6-五沒食子酰基葡萄糖、苯甲酰芍藥苷峰面積，分別采用外標法（external standard method，ESM）和QAMS法計算各組分含量，結果見表10。

2014年，山東將堅持開源與節流并重、城鄉保障與生態保護并行、興利與除害統籌、公益化支撐與市場化運作結合、改革創新與夯實基礎并舉，增強水利發展的內在活力。

表10 ESM法和QAMS法測得的白芍6種成分含量（n=25） mg/g

3 討論

3.1 提取方法的確定在前期試驗方法研究和文獻查閱的基礎上［11-14］，本試驗分別考察了不同濃度乙醇提取溶劑及超聲、回流不同提取方法，發現采用70%乙醇50 mL，超聲（300 W，50 kHz）處理30 min，能夠兼顧上述6種成分，得到最優提取率，雜質干擾峰少，且方法簡單快捷。

3.2 待測化合物的確定色譜峰的準確定位是QASM 應用的關鍵。本研究通過考察保留時間比值和保留時間差2 種參數在不同品牌儀器、不同規格色譜柱中的重現性。保留時間差的波動較為明顯，RSD 在1.62%～5.10%之間，相對保留時間波動較小（RSD＜2.0%），為保證色譜峰的準確定位，結合DAD 檢測器采集到3D 譜圖，比對樣品中各測定成分與相應對照品的光譜圖，以驗證待測成分定位，操作快捷且能夠準確定位待測化合物，為以后研究多成分分析方法的建立提供了新途徑。

3.3 內標化合物的選擇白芍化學成分主要為揮發油類、單萜類、三萜類及黃酮類化合物等，其質量控制一般以主要成分芍藥苷指示成分［15-17］。芍藥苷在白芍中含量達20～30 mg/g，且芍藥苷化學性質穩定，容易取得，故選其作為內參物，選用芍藥苷定量分析時沒食子酸、兒茶素、芍藥苷內酯、1，2，3，4，6-五沒食子酰基葡萄糖、苯甲酰芍藥苷的相對校正因子穩定，定量準確RSD小于2.0%。

3.4 相對校正因子的確定本實驗在儀器、色譜柱、柱溫、流速、pH 值及實驗人員較小變動時，考察了其對相對校正因子的影響程度，結果各待測成分的相對校正因子在測定條件變化小的情況下影響較小，RSD 值均＜1%，按照《一測多評法建立的技術指南》中要求在綜合考慮影響相對校正因子的各種影響因素，在RSD小于5%的情況下，取其平均值作為相對校正因子［4］，因此，選擇各測定條件下的相對校正因子的均值作為最終“一測多評”方法的相對校正因子，通過對不同來源25 批次白芍樣品的測定對“一測多評”法和外標法所得結果進行配對t檢驗分析，結果顯示兩種方法所得白芍藥材6 種含量不存在顯著差異（P＞0.01），且沒食子酸、兒茶素、苯甲酰芍藥苷含量相關性為1，表明“一測多評”法用于白芍中6 種成分的含量測定具有良好的準確性，該法操作簡便快速、準確可靠，可以應用到白芍藥材及配方顆粒的含量測定以達到綠色、環保、節約成本，多指標質量控制的目的。