基于網絡藥理學預測穿心蓮內酯抗呼吸道感染的分子作用機制

黃康勤

廣西河池大化縣人民醫院，廣西 河池 530800

呼吸道感染（respiratory tract infection，RTI）是指由于各種原因導致病原體如細菌、病毒、真菌和寄生蟲等侵襲人體呼吸道引起的感染，臨床癥見流涕、咳嗽、頭痛、咽痛、發熱、乏力、肢體酸痛［1］等，是臨床常見的呼吸系統疾病，全年皆可發病。該病發病率高，人群普遍易染，而且呼吸道感染未及時得到治療可引發中耳炎、支氣管炎、肺炎，甚至敗血癥、腎炎、病毒性心肌炎等全身炎癥癥狀［2］。目前主要以對癥處理為主，予抗病毒藥物聯合抗菌藥物治療，但抗生素選擇的針對性較差，且隨著抗生素長期廣泛應用，耐藥菌株不斷增多，加之抗生素毒副作用相對較大，因此從天然產物尤其是從中藥中分離篩選有效抗菌組分成為抗菌藥物研發領域的研究方向之一。穿心蓮內酯是從穿心蓮Andrographis paniculata（Burm.f.）Nees中分離出的二萜內酯，具有抗炎、抗腫瘤和免疫調節等作用［3］，能抗人體呼吸系統感染，被譽為“天然抗生素”［4］，其潛在機制仍有待研究。

近年來網絡藥理學的迅速發展為中醫藥的研究帶來了契機，給中藥復雜成分研究提供了簡便方法。網絡藥理學是通過整體性研究藥物、靶點、基因、疾病相互之間的網絡關系，綜合觀察和揭示藥物協同干預與影響疾病的作用機制，與中醫整體觀念相似［5］，本研究采用網絡藥理學方法系統探討穿心蓮內酯抗呼吸道感染的分子作用機制。

1 方法與思路

1.1 穿心蓮內酯相關信息及作用靶標預測穿心蓮是一種傳統用作抗炎和抗菌的藥用植物，穿心蓮內酯是穿心蓮的主要活性成分，具有多種藥理活性，包括抗炎、抗癌、抗肥胖、抗糖尿病和其他活性［6］。穿心蓮內酯屬于二萜內酯類成分，這些化合物含有γ-丁內酯部分，該部分由含有四個碳原子和一個氧原子的脂肪族五元環組成，并在氧原子附近的碳上帶有酮基，其化學結構2D 平面結構和3D 分子結構模型見圖1。本研究從Pubchem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）數 據庫下載穿心蓮內酯的化學結構，通過PubMed（http：//kns. cnki. net）、DrugBank（https：//www.drugbank.ca）、Swiss Target Prediction（http：//www. swisstargetprediction. ch/）和BATMAN（http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/index.php）數據庫查找穿心蓮內酯的作用靶標，再經過Uniprot（https：//www.uniprot.org/）數據庫逐一核查是否為人源性靶點并更正基因名。

圖1 穿心蓮內酯化學結構

1.2 呼吸道感染相關信息及作用靶標預測呼吸系統感染是人體常見病和多發病，主要以細菌和病毒感染為主。在一些情況下，病毒感染導致宿主細胞裂解，數百萬拷貝的病毒被釋放，這影響了細胞存活所需的能量平衡，不平衡的能量產生與消耗導致細胞凋亡。一些慢性感染可導致管家基因和細胞蛋白質的表達改變，從而將其轉化為癌細胞或使免疫系統過度活化［7］，在該過程中會引起機體的一系列復雜的生物過程。

CTD 是一個強大的公開數據庫，它提供關于化學-基因/蛋白質相互作用、化學-疾病和基因-疾病關系的人工精選信息。這些數據與功能和途徑數據相結合，有助于發展關于環境影響疾病潛在機制的假設，旨在促進對環境暴露如何影響人類健康的理解。

本研究從CTD、Genecards和DIGSEE數據庫中查找關于呼吸道感染的基因靶點，以“Respiratory Tract Infection”為檢索式，下載數據庫中與呼吸道感染有關的基因靶點，合并去重，并核查是否為人源性靶點，并校對基因名。

1.3 穿心蓮內酯作用于呼吸道感染的靶點蛋白相互作用分析將穿心蓮內酯作用靶標與呼吸道感染有關的基因靶點進行交集，得到重疊靶點，認為這些重疊靶點是穿心蓮內酯對呼吸道感染的潛在作用靶點。將潛在作用靶點信息提交至STRING（https：//string-db.org/）數據庫中進行蛋白互作（Protein-Protein Interaction，PPI）分析，選擇“Homo sapiens”人類為研究機體，設置中度交互分數為0.4，得到潛在作用靶蛋白的PPI 網絡。借助Cytoscape 軟件插件“Network Analyzer”進行拓撲屬性分析，綜合預測相關性較大的關鍵作用靶點。

1.4 穿心蓮內酯對呼吸道感染的潛在作用靶點的生物信息學分析利用Cytoscape 軟件中的插件“Clue GO”對潛在作用靶點進行生物學過程（Biological Process）分析和KEGG 信號通路富集分析。將靶點信息提交至Clue GO，選擇分析基因本體GO-生物學過程，研究條件選擇數據來源于實驗數據［All_Experimental_（EXP，IDA，IPl，IMP，IGI，IEP）］，限定P值＜0.01，得到生物學過程數據。勾選KEGG分析，校正P值＜0.05，得到富集的信號通路。

1.5 分子對接反向驗證穿心蓮內酯與潛在作用靶點的結合性采用IGEMDOCK 軟件進行分子對接，IGEMDOCK 軟件分子對接原理是基于對接位點（即蛋白質-配體相互作用）和化合物性質（即原子組成）使用k-均值和分層聚類方法提供后分析工具［8］，軟件提供交互式界面，以制備靶蛋白結合位點和篩選復合物庫［9］。從PDB 數據庫獲取受體信息即作用靶蛋白信息，下載并保存為PDB 格式；從Pubchem 下載配體即穿心蓮內酯3D 構象的SDF 格式，同時轉變為MOL 格式，將受體蛋白和化合物分子信息輸入軟件后選擇標準對接，其他默認設置，得到分子對接結果。

2 結果

2.1 穿心蓮內酯的作用靶點根據PubMed、DrugBank、Swiss Target Prediction 和BATMAN數據庫，以及文獻檢索查找到穿心蓮內酯的作用靶標122 個，包括腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）、絲裂原活化蛋白激酶3（MAPK3）、缺氧誘導因子1 亞單位α（HIF1α）等，穿心蓮內酯作用靶點的相互作用網絡見圖2，根據作用靶點的度值進行排序，由藍色向紫色漸變，顏色越深表示靶點度值越大，兩個靶點之間的連線粗細體現兩個靶點間交互值大小，線條越粗交互值越大。由網絡圖可見TP53、IL-6、CASP3、MAPK3和TNF是度值較大的靶點。

圖2 穿心蓮內酯作用靶點的蛋白互作網絡圖

2.2 穿心蓮內酯作用于呼吸道感染的潛在作用靶點以呼吸道感染“Respiratory Tract Infection”為檢索式在CTD 數據庫、Genecards 數據庫和DIGSEE 數據庫中查找關于呼吸道感染的基因靶點，其中在CTD數據庫和Genecards數據庫檢索到的靶點中，僅根據作用靶點與呼吸道感染的相關度評分函數各取前300個代表性靶點，3個數據庫搜集到的靶點合并去重后獲得677 個與呼吸道感染相關的靶點。通過VENNY 2.1 在線分析服務器將穿心蓮內酯作用靶標與呼吸道感染相關的靶點交集，得到35 個交集靶點，包含BCL2 凋亡調節劑（BCL2）、血紅素氧合酶1（HMOX1）、腫瘤蛋白p53（TP53）、基質金屬肽酶9（MMP9）等。

2.3 潛在作用靶點的蛋白互作網絡構建及拓撲屬性分析將35 個交集靶點信息導入STRING 數據庫進行蛋白互作分析，利用Cytoscape 軟件將結果進行可視化分析，交集靶點蛋白互作網絡圖見圖3，并對交集靶點蛋白進行拓撲屬性分析，見表1。通過計算分析，發現該網絡平均度值約15.1，平均介數中心性約22.5，平均中心接近度約0.02，如果某個節點在網絡中具有較高的度數和介數中心性可能意味這個節點在整個網絡中具有重要作用，結合網絡圖及拓撲屬性表發現度值和介數中心性均大于均值的節點有8 個，分別是IL6、TP53、TNF、CASP3、SRC、MAPK3、MMP9 和IL1B，說明這8 個靶蛋白可能是穿心蓮內酯作用于呼吸道感染的重要作用靶點。

表1 潛在作用靶點的拓撲屬性

圖3 穿心蓮內酯潛在作用靶點蛋白互作網絡圖

2.4 穿心蓮內酯潛在作用靶點的生物學過程分析經Cytoscape 軟件插件—Clue GO 進行生物學過程分析，得到112 個條目，包括活性氧代謝過程、對白細胞介素1 的反應、調節激素代謝過程、內源性凋亡信號通路的負調節、半胱氨酸型內肽酶活性的負性調節、細胞對抗生素的反應、調節環化酶活性、細胞對氧化應激的反應等，見圖4—5，按照屬性可大致分為12個集群。

圖4 穿心蓮內酯潛在作用靶點的生物學過程分析

圖5 穿心蓮內酯潛在作用靶點的生物學過程分析

2.5 穿心蓮內酯潛在作用靶點的信號通路分析經Clue GO 對潛在作用靶點進行富集分析，校正P值＜0.05 得到包括NF-κB 信號通路、炎癥性腸病（IBD）、p53 信號通路、ErbB 信號通路、TRP通道的炎癥介質調節、甲狀腺激素信號通路、GnRH信號通路等95條信號通路，通路信息見表2。

表2 穿心蓮內酯潛在作用靶點富集的信號通路

2.6 穿心蓮內酯與潛在作用靶點的結合性通過IGEMDOCK 軟件進行分子對接，得到分子對接評分函數。由于IGEMDOCK 軟件采用的是經驗打分函數，其經驗評分函數估計是使用“結合能=范德華力+氫鍵”公式計算得到［10］，化合物分子與受體結合作用可能性越大，則兩者間結合能量越低，結合更穩定。穿心蓮內酯與潛在作用靶蛋白靶點結合能平均值在-93.0kcal/mol 以上，預測出結合最穩定的是TNF與穿心蓮內酯的結合。見表3。

表3 分子對接結果

3 討論

穿心蓮內酯具有廣泛的生物活性，如抗炎、抗過敏、抗血小板聚集、抗艾滋病毒等［11］，臨床多用于治療感冒、咽喉痛、流感及呼吸系統感染。本研究通過大數據信息篩查穿心蓮內酯的作用靶點與呼吸道感染相關的發病靶點，預測有35 個靶點是穿心蓮內酯抗呼吸道感染的潛在靶點，包括MAPK3、MMP9、BCL2、HMOX1、細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑2A（CDKN2A）、絲裂原活化蛋白激酶14（MAPK14）等；通過對潛在作用靶點進行蛋白互作分析，得到8 個靶點（IL6、TP53、TNF、CASP3、SRC、MAPK3、MMP9 和IL1B）是較重要的潛在作用靶點。MMPs（基質金屬肽酶）是一類依賴Zn2+和Ca2+的超家族成員，可降解的細胞外基質蛋白酶在維持細胞外基質的穩定性方面有重要意義，而在炎癥性疾病中MMPs 發揮溶解細胞外基質和破壞基膜的作用，MMP9 參與了炎癥、血管形成和腫瘤侵襲轉移等病理生理過程［12］，有研究表明穿心蓮內酯可通過NF-κB p65 亞基的核移位和iκb 磷酸化、降低MMP-9 的表達和活性發揮抗肺癌作用［13］。HMOX1（血紅素加氧酶1，HO-1）是參與血紅素降解的一種酶，在血紅素降解的發病機制中起重要作用［14］，具有抗炎和抗氧化作用，可調節宿主先天性和適應性免疫應答，以響應敗血癥、移植和自身免疫反應，并防止與炎癥相關的氧化損傷［15］，有體外數據表明HO-1 誘導可以調節細胞，特別是氣道上皮細胞對hRSV（呼吸道合胞病毒）感染的易感性［16］，LU等［17］實驗發現穿心蓮內酯部分地通過抑制NADPH氧化酶活化，誘導HO-1 和GCLM（谷氨酸半胱氨酸連接酶修飾亞基）表達以減弱TNF-α誘導的ICAM-1表達；SRC 蛋白酪氨酸激酶被認為是許多細胞過程中的重要信號傳遞者，如生長、基因轉錄、黏附和凋亡，SRC 在介導TNF-α誘導的ICAM-1 磷酸化中發揮重要作用，這對多核白細胞黏附至關重要，而穿心蓮內酯可抑制TNF-α誘導的SRC 磷酸化。推測穿心蓮內酯通過調控相關基因的表達與否，可進一步干預疾病的發生發展，并且這些實驗研究也反向證明預測的穿心蓮內酯作用靶點具有一定準確性。

對穿心蓮內酯的作用靶點進行生物學過程分析和信號通路富集分析，得出這些靶點參與112種生物學過程，涉及活性氧代謝過程、對IL-1 的反應、調節激素代謝過程、細胞對氧化應激的反應、內源性凋亡信號通路的負調節、半胱氨酸型內肽酶活性的負性調節等，富集出95 條信號通路，如NF-κB 信號通路、炎癥性腸病（IBD）、p53 信號通路、ErbB 信號通路、TRP 通道的炎癥介質調節等。查閱文獻發現穿心蓮內酯治療呼吸道感染與NF-κB信號通路有密切關系，DING 等［18］在研究穿心蓮內酯在流感病毒感染的小鼠體內的抗流感活性，其機制研究表明穿心蓮內酯的活性與NF-κB和jak-stat信號通路有關，穿心蓮內酯可通過抑制NF-κB p65的磷酸化水平減輕LPS誘導的小鼠急性肺損傷［19］。LEE 等［20］探究了穿心蓮內酯對小鼠過敏原誘導的氣道炎癥的機制，發現穿心蓮內酯可以抑制stat3 介導的NF-κB 通路，在lps（脂多糖）刺激的raw264.7 巨噬細胞中發揮抗炎作用，能降低氣道炎癥反應。其他通路如p53 信號通路、ErbB 信號通路、癌癥信號通路、炎癥性腸病（IBD）通路等也有相關性，但穿心蓮內酯通過干預這些信號通路來調控呼吸道感染的文獻報道較少，因此后期有必要通過實驗驗證這些信號通路。此外無論是生物學過程還是信號通路都是多個基因靶點共同參與或調控，映射了中醫藥多成分、多靶點、多途徑的特點。通過分子對接技術反向驗證穿心蓮內酯與預測到的作用靶點之間的結合性良好，表明基于大數據的篩選與預測具有一定準確性。

本研究運用網絡藥理學方法系統探究穿心蓮內酯抗呼吸道感染的效應機制，科學收集和預測穿心蓮內酯的有效化學成分和作用靶點，從藥物、基因、靶點、疾病網狀關系探究四者之間的聯系，由于本研究是基于大數據的篩選和預測，具有一定局限性，后期仍需真實世界進行驗證。