基于網(wǎng)絡(luò)藥理學的過敏煎治療過敏性哮喘分子機制研究?

陶 鑫，薛中峰，覃驪蘭

廣西中醫(yī)藥大學，廣西 南寧 530001

過敏性哮喘是一種以IgE 介導的，由變應原引發(fā)的過敏性哮喘疾病，易感人群容易出現(xiàn)喘息、氣促、胸悶和咳嗽等由炎癥引起的癥狀［1］。過敏性哮喘是一種相對難以治愈的疾病，如果忽視治療，則遷延不愈甚至伴隨終生。過敏性哮喘屬中醫(yī)學“哮證”范疇［2］，病機多以痰為主，由肺脾腎功能失常導致。津液凝聚，痰聚于肺，受外邪、情志、飲食等因素引而發(fā)之。

現(xiàn)代醫(yī)學治療過敏性哮喘多用地塞米松腎上腺皮質(zhì)激素，療效不甚理想，且有嚴重的副作用如滿月臉、水牛肩等。中醫(yī)藥以整體調(diào)節(jié)的優(yōu)勢在防治哮喘復發(fā)和加重方面具有確切作用［3］。

過敏煎（Guomin Jian，GMJ）為名老中醫(yī)祝湛予所創(chuàng)名方，臨床常用于治療多種過敏性疾病，如過敏性哮喘、過敏性皮炎、腸易激綜合征等。方中防風發(fā)散解表，善于祛風，善治諸般風疾；銀柴胡清熱涼血，發(fā)散風寒；五味子味酸性溫，固精斂汗；甘草補脾益氣，全方正合哮證病機。防風的主要成分為防風色酮、升麻素，具有解熱、抗炎功效；銀柴胡的主要成分為甾醇類、環(huán)肽類，有抗炎、擴張血管作用；五味子含五味子素、五味子多糖，具有興奮呼吸中樞，止咳祛痰作用；甘草含有甘草苷和甘草酸，具有抗菌消炎作用。由于中藥復方成分復雜，作用機制不清，發(fā)掘復方的潛在分子機制仍然困難。隨著網(wǎng)絡(luò)藥理學的提出，單一靶標的研究逐步轉(zhuǎn)向整體、系統(tǒng)的調(diào)節(jié)研究，通過生物數(shù)據(jù)庫構(gòu)建“中藥-有效成分-靶基因-疾病”可視化中藥調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，進而闡明中藥復方的作用機制，實現(xiàn)分子作用的綜合網(wǎng)絡(luò)分析，最終從整體角度了解中藥與機體的相互作用［4-5］。因此，本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學方法研究過敏煎治療過敏性哮喘的作用機制，進行從單一到整體、從部分到系統(tǒng)的研究，現(xiàn)報道如下。

1 方法

1.1 復方有效成分及靶點獲得通過中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）檢索過敏煎中藥的化學成分，并根據(jù)化合物類藥性（drug-likeness，DL）＞0.18，口服生物利用度（oral bioavailability，OB）＞30%篩選藥物活性成分。通過Uniprot 數(shù)據(jù)庫規(guī)范篩選出的靶點名稱，建立藥物活性成分靶點數(shù)據(jù)集的Drug.txt文件。

1.2 疾病相關(guān)基因獲得檢索詞：Allergic asthma，在Genecards（https：//www.genecards.org/）與OMIM（https：//omim.org/）兩個數(shù)據(jù)庫中檢索疾病相關(guān)基因；將上述預測靶基因合并作為疾病相關(guān)基因數(shù)據(jù)的Disease.txt文件。

1.3 藥物治療疾病的可能靶點獲得采用Draw Venny Diagram在線程序（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）將Disease 和Drug 靶基因取交集獲得單味藥與疾病的共同靶點，此集合為單味藥治療疾病的可能靶點，生成Drug-Disease.txt文件。

1.4 藥物、疾病、靶基因網(wǎng)絡(luò)圖繪制采用Cytoscape 3.7.1繪制藥物、疾病、靶基因網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將Drug-Disease.txt 中的基因提交至String 網(wǎng)站（https：//string-db.org/），minimum required interaction score為highest confidence：0.900生成PPI互作網(wǎng)絡(luò)圖及string-interactions.tsv 文件（使用0.900結(jié)果）。相關(guān)網(wǎng)絡(luò)參數(shù)見文件夾下“參數(shù).txt”。

1.6 統(tǒng)計條圖生成利用perl語言，在stringinteractions.tsv 文件提取關(guān)鍵基因連接度蛋白統(tǒng)計條圖（排名前30），所有節(jié)點連接度統(tǒng)計結(jié)果見count.xls文件。

1.7 基因名稱轉(zhuǎn)換為基因ID利用R3.6.0 軟件，安裝RSQLite 包及org.Hs.eg.db 包，將Drug-Disease.txt 中基因名稱轉(zhuǎn)換為基因ID，為京都基因(gene ontology，GO)和基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)富集分析做準備，生成id.txt文件。

1.8 GO 分析利用R3.6.0 軟件，安裝Bioconductor 的colorspace、stringi、DOSE、cluster-Profiler、pathview、ggplot2等程集包，根據(jù)id.txt文件進行GO 富集分析，獲得條圖和氣泡圖（展示前20 條統(tǒng)計學最顯著結(jié)果）；將基因id 轉(zhuǎn)換為基因Symbol，獲得所有統(tǒng)計顯著性結(jié)果Excel 形式的統(tǒng)計文件GO.xls。利用ggplot2程集包進行GO的BP、CC、MF 分類輸出，條圖及氣泡圖存儲在GO2文件夾下。

1.9 KEGG分析利用R3.6.0軟件，安裝Bioconductor 的colorspace、stringi、DOSE、cluster Profiler、pathview 等程集包，根據(jù)id.txt 文件進行KEGG 富集分析，獲得條圖和氣泡圖（展示前20 條統(tǒng)計學最顯著結(jié)果）；將基因id 轉(zhuǎn)換為基因Symbol，獲得所有統(tǒng)計顯著性結(jié)果Excel 形式的統(tǒng)計文件KEGG.xls及通路圖文件。

2 結(jié)果

2.1 過敏煎的有效成分得到復方中銀柴胡10個、烏梅8個、甘草91個、五味子8個、防風18個，共計141個活性成分。化合物主要包括：五味子素C（WuweizisuC）、β-谷固醇（beta-sitosterol）、山柰酚（kaempferol）、豆甾醇（Stigmasterol）、異鼠李素（isorhamnetin）等，具體活性成分的OB（生物利用度）和DL（類藥性）值見表1。

表1 過敏煎活性成分的OB和DL值（排名前30）

2.2 過敏煎活性成分-治療過敏性哮喘靶點預測將TCMSP、DrugBank 數(shù)據(jù)庫得到的所有靶點，由OMIM和Genecards數(shù)據(jù)庫篩選整合得到過敏性哮喘相關(guān)作用靶點共1708 個，將過敏煎活性成分與過敏性哮喘相關(guān)靶點取交集得到134 個藥物有效成分-疾病相關(guān)靶點。見圖1。

圖1 過敏煎活性成分靶點與過敏性哮喘的靶點預測結(jié)果

2.3 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析通過Cytoscape 3.2.1軟件將上述預測篩選結(jié)果構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)：過敏煎活性化合物治療過敏性哮喘靶點網(wǎng)絡(luò)圖見圖2—3。

圖2 過敏煎活性成分靶點與過敏性哮喘作用靶點

可知過敏煎治療的核心靶點為STAT3、JUN、RELA、AKT1、MAPK1、MAPK3 等，為了進一步了解過敏煎對過敏性哮喘的治療作用，將韋恩圖得到的134 個交集基因靶點通過STRING 數(shù)據(jù)庫進行PPI網(wǎng)絡(luò)分析，結(jié)果見圖4。

圖4 過敏煎治療過敏性哮喘潛在靶點之間的互作網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 GO分類富集分析經(jīng)DAVID數(shù)據(jù)庫分析，共得到141 條富集結(jié)果，選取P 值排名前20 的做GO分類富集分析，結(jié)果顯示過敏煎治療過敏性哮喘的生物過程主要為細胞因子受體結(jié)合、細胞因子活性、蛋白磷酸酶活性與結(jié)合等。見圖5。

圖5 過敏煎治療過敏性哮喘GO分類富集分析

2.5 KEGG 分類富集分析利用DAVID 數(shù)據(jù)庫對過敏煎的基因進行KEGG 通路富集分析，共獲得164 條通路，見圖6。前20 條富集結(jié)果主要為AGE-RAGE 信號通路、IL-17 信號傳導途徑、TNF 信號通路、HIF-1 信號傳導途徑、Toll 樣受體信號通路、PI3K-Akt信號通路等。

圖3 過敏煎治療過敏性哮喘的重要靶點柱狀圖

3 討論

中藥成分復雜、配伍靈活的特點使其在過敏性疾病（過敏性哮喘、過敏性鼻炎、蕁麻疹）的治療中與西藥相比具有優(yōu)勢，但其局限性在于起效較慢，作用機制不明確。伴隨著網(wǎng)絡(luò)藥理學的興起，大數(shù)據(jù)分析和“多成分-多靶點”研究方法的廣泛應用為中藥作用機制研究提供了新方法［6］。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學技術(shù)，結(jié)合對應的數(shù)據(jù)庫和軟件，對過敏煎治療過敏性哮喘的作用機制進行研究，從方中防風、烏梅、銀柴胡、五味子、甘草中篩選，共獲得141 個活性成分，與疾病的交集基因靶點134個和164條通路，說明過敏煎治療過敏性哮喘是多成分多靶點共同作用的結(jié)果。

本研究結(jié)果顯示，在化合物靶點網(wǎng)絡(luò)中異鼠李素（isorhamnetin）可以抑制肺腫瘤細胞A549的生長，從而抑制MMP2 和MMP9 蛋白表達［7］，β-谷固醇（beta-sitosterol）對LPS 所致小鼠急性肺損傷有較好保護作用，其保護機制可能與阻止炎癥因子（TNF-α、IL-6）的釋放和下調(diào)NF-κB 信號轉(zhuǎn)導通路的活化有關(guān)［8］，山奈酚能夠緩解氧化低密度脂蛋白誘導的人靜脈內(nèi)皮細胞損傷，這與山奈酚促進AMPK/Nrf2/HO-1信號通路的激活有關(guān)［9］。

GO 功能富集分析結(jié)果顯示，過敏煎的療效涉及多個生物過程，主要以細胞因子受體結(jié)合、細胞因子活性、蛋白磷酸酶活性與結(jié)合等為主，白細胞介素17（interleukin-17，IL-17）主要是由Th17細胞分泌，是常見促炎因子，可以促進白細胞遷移和活化，在自身免疫性疾病、腫瘤等疾病中發(fā)揮重要作用［10］。

KEGG 通路分析顯示，過敏煎治療過敏性哮喘涉及多個通路，主要為AGE-RAGE 信號通路、IL-17信號傳導途徑、TNF 信號通路、HIF-1 信號傳導途徑、Toll 樣受體信號通路等。大量研究發(fā)現(xiàn)，Th17 細胞是一類強有力的促炎細胞，可動員、募集和活化中性粒細胞，并與其所產(chǎn)生的細胞因子如IL17A、IL17F 等共同參與自身免疫性疾病如RA、哮喘、SLE、銀屑病、MS等疾病的病理進展［11-12］。NF-κTHFα通路貝母素甲與TNF-α能下調(diào)炎癥反應信號通路中MAPKs磷酸化水平，降低B基因的轉(zhuǎn)錄強度，從而減少TNF-α、IL-6 等促炎細胞因子表達［13］。故IL-17 信號通路和TNF 信號通路為本研究所預測的主要通路。用卵清蛋白誘導的哮喘小鼠Toll 受體模型、BML-111 或IL-1β抗體治療均能阻止其炎癥變化［14］。

綜上所述，基于網(wǎng)絡(luò)藥理學方法和技術(shù)分析的過敏煎治療過敏性哮喘的活性成分、靶點以及信號通路等，從多層次、多角度經(jīng)過多次篩選重要活性成分，獲得的重要信號節(jié)點是網(wǎng)絡(luò)藥理學的特點［15］。本研究從數(shù)據(jù)網(wǎng)絡(luò)角度分析過敏煎治療過敏性哮喘的作用機制，為以后探究過敏煎治療機制提供了思路與基礎(chǔ)，但具體作用機制還需進一步研究與驗證。