溫腎化痰方對動脈粥樣硬化模型大鼠主動脈血管平滑肌細胞凋亡及細胞內膽固醇酯的影響?

巫燕慧，林海丹，陳英男，張 忠△，黃若蘭

1 深圳市鹽田區人民醫院/南方科技大學鹽田醫院，深圳 518000；2 廣州中醫藥大學深圳市中醫院；3 深圳大學總醫院

動脈粥樣硬化性心血管疾病（atherosclerotic cardiovascular disease，ASCVD）是全球范圍內人類死亡的主要原因，世界衛生組織預測，到2020年心血管疾病將成為全世界第一死因［1］。動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是ASCVD 最基本的病理改變，是由大量脂質沉積在動脈管壁形成脂肪條紋而后逐漸發展成粥樣斑塊并引發多種并發癥的慢性動脈疾病［2］。研究認為AS既是一種慢性炎癥性疾病，又是一種脂質代謝紊亂造成的疾病［3］。細胞脂質代謝中膽固醇的代謝失衡可促進AS 的發生及進展［4］，而血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）的凋亡則導致細胞外基質（覆蓋斑塊的纖維帽的主要成分）分泌減少，使斑塊纖維帽變薄、降解，加劇斑塊不穩定，甚至發生破裂［5-6］，從而導致發生不良心血管事件（cardiovascular events，CVE）。

溫腎化痰方由廣東省名中醫羅陸一教授在二仙湯基礎上化裁而成，由仙茅、淫羊藿、石菖蒲、瓜蔞皮、乳香組成。前期研究發現該方具有降低小鼠低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）、甘油三酯（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）含量，下調主動脈平滑肌細胞Orail、Caspase 3、Caspase 9、Bax 基因及蛋白表達，上調Bcl-2基因及蛋白表達作用［7］。本實驗通過檢測不同濃度溫腎化痰方對氧化低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，ox-LDL）誘導的大鼠主動脈血管平滑肌細胞凋亡及細胞內膽固醇酯含量的影響，為溫腎化痰方防治AS提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物60只6 周齡健康雄性Wistar 大鼠，SPF級，體質量（250±10）g，購自廣東省醫學實驗動物中心三水基地（批號：44411600003988），實驗動物合格證號：SCXK（粵）2014-0035。本實驗在廣州中醫藥大學實驗動物中心SPF 實驗室進行。飼養條件為每日光照12 h、黑暗12 h，循環進行，飲食、飲水不受限制。本實驗通過廣州中醫藥大學醫學實驗動物倫理委員會審查。

1.2 主要試劑與儀器平滑肌細胞培養基（smooth muscle cell medium，SMCM）培養液（美國Gibco，批號：1427263）；胎牛血清（美國Gibco，批號：1414426）；二甲基亞砜DMSO（德國默克SIGMA-ALDRICH，批號：Lot SHBB3758V）；Formazan溶解液DMSO（北京索萊寶M1020，批號：Lot NO20180312 SHBB3758V）；Annexin V-FITC 細胞凋亡檢測試劑盒（Beyotime C1062M，批號：111117180621）；總膽固醇檢測試劑盒（南京建成A111-1）；游離膽固醇檢測試劑盒（上海索萊寶BC1895）；恒溫細胞培養箱（Thermo HERAcell 150i）；倒置生物顯微鏡（OPTEC BDS200-PH）；解剖鏡（廣州明美光電技術有限公司）；熒光顯微鏡（廣州明美光電技術有限公司）；酶標儀（Thermo Multiskan Mk3）；TDL-80-2B 型低速臺式離心機（上海安亭科學儀器廠飛鴿）；WD-9405B 型水平搖床（北京六一生物科技有限公司）；SW-CJ-1FD型無菌超凈臺（蘇潔凈化）；96孔板（美國Corning）；中藥煎煮機（北京東華原醫療設備廠YFY2020000mL）；LABOROTA4000 型旋轉蒸發儀（德國Heidolph 公司）；K2800 型微量分光光度計（北京凱奧科技有限公司）。

1.3 含藥血清制備

1.3.1 中藥制備 溫腎化痰方藥物組成：仙茅10 g，淫羊藿10 g，石菖蒲15 g，瓜蔞皮15 g，乳香15 g（由廣州中醫藥大學第一附屬醫院中藥房提供）。制備：煎藥前先將飲片制成粗粉，按比例取以上藥物加8 倍量水浸泡30 min，加熱煮沸后再煎煮30 min 取汁；第二煎加5 倍量水直接加熱，煮沸后煎煮30 min 取汁：合并2 次藥液，以4 層棉紗布過濾。將濾液用旋轉蒸發儀（蒸發溫度≤60℃）濃縮成含生藥0.5265 g/mL 的藥液，常溫冷卻后，置于4℃冰箱內保存使用。

1.3.2 取血清時間篩選 以中劑量溫腎化痰方提取液（10.053 g/kg，相當于70 kg 成人等效劑量2 倍［8］）灌胃給藥，灌胃容量為每次0.5 mL，每日2次，連續5天。第5天灌胃結束后0.5、1、2、3、4 h，每個時間點每組取2 只大鼠麻醉并固定，腹主動脈取血，4℃，離心半徑13.5 cm，13000 r/min 離心10 min，分離出上清液，經0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌后用高效液相色譜法測定溫腎化痰方有效成分揮發油類、三萜類、黃酮類含量，比較不同時間點的結果差異，篩選出溫腎化痰方含藥血清的最佳取材時間為3 h。

1.3.3 含藥血清制備及分組 采用隨機數字表法將32 只Wistar 大鼠分為空白組及低、中、高劑量中藥組，每組8 只。低、中、高劑量中藥組分別按照5.256、10.053、20.106 g/（kg·d）溫腎化痰方提取液（給藥量相當于70 kg 成人等效劑量1、2、4倍［8］）灌胃給藥，每次0.5 mL，每日2 次，空白組灌胃等劑量生理鹽水，連續5天。第5天灌胃結束3 h后麻醉大鼠并固定，腹主動脈取血，分離上清液，經0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌后，儲存于-80℃冰箱備用。

1.4 干預方法

1.4.1 大鼠主動脈平滑肌細胞分離 處死Wistar大鼠，分離、沖洗、裁剪備用。將小組織塊種于25 cm2培養瓶底，加入SMCM 培養基（含雙抗、FBS、平滑肌細胞生長補充物）1 mL，置于5%CO2、37℃飽和濕度培養箱內孵育約3～5 h，當組織塊自然黏附于瓶壁后把培養瓶放平，使組織塊完全浸入到培養液中，繼續置于培養箱內培養，每隔3 天更換培養基，組織塊周圍的細胞生長至70%時（16～20天）即可傳代。吸去舊培養基，0.01 mol/L PBS 清洗，加入2.5 g/L 胰蛋白酶消化液，室溫下消化約2 min，加入SMCM 培養基終止消化，離心、去上清、重懸細胞，處理后置光學顯微鏡下觀察：藍色細胞為異常或死亡細胞，活細胞不著色，并行計數后傳代培養，每隔2 天換液1 次，待細胞融合成致密單層后可再次傳代。取培養的P2 代細胞，以每孔2×105個細胞接種于內置有蓋玻片的24孔板中培養，24 h 后待細胞自然貼壁、生長良好時，取出蓋玻片，沖洗、孵化，復染核10 min，在熒光顯微鏡下觀察并進行血管平滑肌細胞鑒定。將鑒定合格的血管平滑肌細胞接種到6 孔培養板中，置5%CO2、37℃孵箱培養2 h 后去上清液，洗去未貼壁細胞，繼續培養3天后隨機分組。

1.4.2 分組 分離的主動脈平滑肌細胞繼續在6 孔培養板培養第3 天后分為：1）正常組：10%Gibco 血 清；2）對 照 組：ox-LDL 70 mg/L［9］+10%Gibco 血清；3）低劑量中藥組：ox-LDL 70 mg/L+低劑量中藥含藥血清；4）中劑量中藥組：ox-LDL 70mg/L+中劑量中藥含藥血清；5）高劑量中藥組：ox-LDL 70 mg/L+高劑量中藥含藥血清。所有分組加入血清后均作用于細胞12 h。

1.5 觀察指標

1.5.1 主動脈平滑肌細胞存活率 細胞培養第3 天，藥物處理后96 孔板每孔加入10 μL MTT 溶液，細胞培養箱內孵育4 h。每孔加入100 μL Formanzan 溶解液，細胞培養箱內繼續孵育，直至在普通光學顯微鏡下觀察發現Formanzan 全部溶解。37℃孵育4 h左右，紫色結晶全部溶解。用酶標儀在492 nm 處測定吸光度。計算細胞存活率。實驗重復3 次，每次每組設4～5 個復孔。細胞存活率（%）=處理組OD值/對照組OD值×100%。

1.5.2 主動脈平滑肌細胞凋亡水平 1）將貼壁細胞用0.25%的胰酶消化，于室溫離心半徑13.5 cm，2000 r/min離心5～10 min，收集細胞，用去離子水將10×Binding Buffer稀釋成1×Binding Buffer，用預冷1×PBS（4℃）重懸細胞1次，離心半徑13.5cm，2000 r/min 離心5～10 min，洗 滌 細胞；2）加入300 μL的1×Binding Buffer懸浮細胞，加入5 μL的Annexin V-FITC 混勻后避光，室溫孵育15 min進行標記；3）上機前5 min再加入5 μL PI染色，用流式細胞儀檢測，激發波長Ex 為488 nm，發射波長Em 為530 nm，Annexin V 綠色熒光通過FITC 通道（FL1）檢測，PI 紅色熒光通過PI通道（FL2或FL3）檢測，進行熒光補償調節：使用未經凋亡誘導處理的正常細胞，作為對照進行熒光補償調節去除光譜重疊和設定十字門的位置；4）以FITC和PI熒光作雙參數點圖，以Annexin V FITC 為橫軸，PI 為縱軸，將細胞分為4 個區，1 區：機械損傷細胞（Annexin V FITC-/PI+）；2區：凋亡晚期或壞死細胞（Annexin V FITC+/PI+）；3區：存活細胞（Annexin V FITC-/PI-）；4 區：早期凋亡細胞（Annexin V FITC+/PI-）。實驗重復3次。

1.5.3 主動脈平滑肌細胞內膽固醇酯水平 收集各組細胞，PBS 洗滌3 次，重懸于0.5 mL 磷酸鈉緩沖液（pH 7.4，0.1 mol/L）中，超聲波裂解細胞取上清液，微量分光光度計檢測TC 和游離膽固醇（free cholesterol，FC）濃度。以考馬斯亮藍G-250 法測定各組細胞樣品中蛋白質含量，細胞內總膽固醇含量用每毫克蛋白所含膽固醇含量表示，反應液中省去膽固醇酯酶用以檢測游離膽固醇。細胞內膽固醇酯（cholesteryl ester，CE）=TC-FC。

1.6 統計學方法采用SPSS 20.0 軟件分析數據，計量數據以±s表示，兩組間比較采用非配對t檢驗，多組比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 主動脈平滑肌細胞存活率與正常組比較，對照組主動脈平滑肌細胞存活率下降（P＜0.01）。與對照組比較，低、中、高劑量中藥組主動脈平滑肌細胞存活率增加（P＜0.01）。與低劑量中藥組比較，中、高劑量中藥組主動脈平滑肌細胞存活率增加（P＜0.01）。與中劑量中藥組比較，高劑量中藥組細胞主動脈平滑肌細胞存活率增加（P＜0.01）。見表1。

表1 各組主動脈平滑肌細胞存活率比較（±s） %

表1 各組主動脈平滑肌細胞存活率比較（±s） %

注：*表示與正常組比較，P＜0.01；△表示與對照組比較，P＜0.01；▲表示與低劑量中藥組比較，P＜0.01；○表示與中劑量中藥組比較，P＜0.01

組別正常組對照組低劑量中藥組中劑量中藥組高劑量中藥組第1次實驗107.45±0.55 44.87±0.38 60.27±0.43 84.33±0.44 91.79±0.44第2次實驗108.05±0.51 45.04±0.46 60.70±0.50 83.88±0.34 92.49±0.51第3次實驗108.45±0.51 45.63±0.44 61.08±0.29 85.39±0.43 93.33±0.53平均值107.98±0.69 45.18±0.56*60.68±0.55△84.53±0.78△▲92.54±0.83△▲○

2.2 主動脈平滑肌細胞凋亡水平正常組、對照組及低、中、高劑量中藥組主動脈血管平滑肌細胞凋亡率分別為（5.42±0.05）%、（39.51±0.44）%、（29.67±0.18）%、（20.44±0.50）%、（8.01±0.20）%。與正常組比較，對照組主動脈平滑肌細胞凋亡水平升高（P＜0.01）。與對照組比較，低、中、高劑量中藥組主動脈平滑肌細胞凋亡水平均下降（P＜0.01）。與低劑量中藥組比較，中、高劑量中藥組主動脈平滑肌細胞凋亡水平下降（P＜0.01）。與中劑量中藥組比較，高劑量中藥組主動脈平滑肌細胞凋亡水平下降（P＜0.01）。見圖1。

圖1 各組大鼠主動脈血管平滑肌細胞凋亡率比較

2.3 主動脈平滑肌細胞內膽固醇酯與正常組比較，對照組TC 及CE 水平升高（P＜0.01）。與對照組比較，低、中、高劑量中藥組細胞內TC及CE水平降低（P＜0.01）。與低劑量中藥組比較，中、高劑量中藥組細胞內TC 及CE 水平降低（P＜0.01）。與中劑量中藥組比較，高劑量中藥組細胞內TC 及CE水平降低（P＜0.01）。各給藥組FC比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組大鼠細胞內膽固醇酯比較（±s）

表2 各組大鼠細胞內膽固醇酯比較（±s）

注：*表示與正常組比較，P＜0.01；△表示與對照組比較，P＜0.01；▲表示與低劑量中藥組比較，P＜0.01；○表示與中劑量中藥組比較，P＜0.01

組別正常組對照組低劑量中藥組中劑量中藥組高劑量中藥組TC（mmol/L）0.25±0.02 0.89±0.04*0.68±0.08△0.51±0.07△▲0.40±0.07△▲○FC（μmol/L）56.32±0.38 60.83±0.26 59.32±0.14 58.35±0.34 57.49±0.23 CE（mg/L）22.05±2.13 107.87±5.82*75.75±10.07△51.89±7.69△▲42.51±9.03△▲○

3 討論

中醫學無ASCVD 病名，根據其癥狀屬“胸痹”“心痛”范疇。《素問·五藏生成篇》載：“心之合脈也，其榮色也，其主腎也”，腎陽為一身陽氣之根本，心陽依賴于腎陽之溫煦。因腎陽虛衰，氣化失職，致水液輸布運化失常，聚濕成痰，痰阻心胸；腎陽虛損，無力溫煦心陽，使心氣推動血液運行無力，血脈運行緩慢，瘀阻于心脈［10］。中醫藥治療AS 療效較好，涉及調節脂質代謝、抗氧化、抗炎、保護血管內皮細胞、穩定斑塊等機制［11-12］。

溫腎化痰方由仙茅、淫羊藿、石菖蒲、瓜蔞皮、乳香組成。方中仙茅、淫羊藿為君藥，仙茅溫陽補腎，強筋骨，通經脈；淫羊藿性辛、甘、溫，歸肝、腎經；石菖蒲辛溫，開竅豁痰，配合瓜蔞皮寬胸理氣開痰結，消痰散結以治其標；乳香性溫，味辛善行，能行血分瘀滯，開經絡壅滯，并載諸藥直達病所，為引經佐使藥。全方溫補、消痰并用，以溫腎助陽為主，活血化痰為輔。對胸痹心腎陽虛患者單純使用活血化瘀藥療效不足，而以溫腎為本、化痰散瘀藥為輔的溫腎化痰方，方中有補有瀉，用于冠狀動脈粥樣硬化性疾病，有一定依據［7，13］。

AS 是以血管內皮損傷和血管平滑肌細胞移行增殖為基礎的病變，其中血管平滑肌細胞的增殖和凋亡對AS 的發生、發展起重要作用［14］。正常生理狀態下，血管平滑肌細胞增殖與凋亡維持相對平衡狀態。當機體處于氧化應激等條件下，沉積于大中動脈內膜下的LDL 容易發生氧化修飾，形成ox-LDL［15］，從而促進血管平滑肌細胞凋亡、轉化成泡沫細胞，促進血栓形成，同時誘導產生基質金屬蛋白酶，促進AS斑塊的不穩定性［16-17］，也可促進LOX-1 的表達，導致血管平滑肌細胞發生凋亡，加重斑塊不穩定性，從而導致斑塊破裂［18］。溫腎化痰方可減少血管平滑肌細胞凋亡，保持其穩定的存活率，進而使血管平滑肌細胞增殖與凋亡維持在平衡狀態，延緩AS的進展。

高脂血癥是AS 發病的一個重要危險因素［19］。早期血液中單核細胞在血管平滑肌細胞功能受損時遷移至內皮，分化成巨噬細胞，攝入大量脂質，各種因素作用下大量膽固醇酯聚積至細胞轉化成泡沫細胞，而泡沫細胞是AS 斑塊形成脂質條紋的特征性標志，泡沫細胞內的脂滴存在的主要脂質是膽固醇，故膽固醇代謝平衡在AS 發生和發展過程中發揮重要作用［20］。溫腎化痰方可降低主動脈平滑肌細胞內總膽固醇及膽固醇酯含量，減少細胞泡沫化，從而延緩AS 進程，且在一定劑量范圍內，隨著濃度的增加，其作用效果也增加。

本研究用中藥血清藥理學方法，證明溫腎化痰方可有效減少ox-LDL 誘導的大鼠主動脈血管平滑肌細胞凋亡，有效抑制血管平滑肌細胞凋亡，保護血管平滑肌細胞，減輕主動脈血管重構，同時減少細胞內總膽固醇及膽固醇酯含量，減少泡沫細胞形成，從而延緩AS 發生發展。課題組未來將通過檢測相關炎性因子及mRNA 表達進一步探討其作用機制。