甲狀腺癌Her2 靶向雙模態分子探針的制備及表征

田洪達，李忠原，郝利國，高曉隆，劉強，李春香

1.齊齊哈爾醫學院，黑龍江齊齊哈爾 161006；2.齊齊哈爾醫學院附屬第一醫院，黑龍江齊齊哈爾 161041

國內，甲狀腺癌處于內分泌惡性腫瘤發病率前列[1]，女性甲狀腺癌的發病率逐年升高。其中，年齡60 歲以上的人群中，甲狀腺結節發病率高達50%～70%[2]。未分化甲狀腺癌的惡性程度遠高于其他種類的甲狀腺癌，臨床癥狀主要為瘤組織腫大壓迫氣管造成的呼吸困難，同時伴有遠處轉移等。目前影像學對甲狀腺癌的早期定性診斷仍具有一定的局限性，隨著技術的進步，分子影像學發展迅速，使多模態納米探針對于明確未分化甲狀腺癌的診斷和進展成為可能。分子探針是實現分子影像顯像的核心技術，是一種功能性物質，能精確地體現特定對象的生物學問題[3]。目前磁共振成像中，常用釓劑做增強對比劑，其毒性低且改變了病變的信號，提高了與周圍正常組織的對比度，但缺乏靶向性。人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor，Her2），可 特 異 性 與 細 胞 結 構 域II 結合[4]。不僅可以在乳腺癌中表達，還在多種甲狀腺癌中表達擴增[5-6]。結合目前的分子影像學發展，可以通過以Her2 為靶點，合成一種以磁共振造影劑Gd3+、熒光染料Cy5.5、靶向物質pertuzumab 偶聯的雙模態探針，并檢測其表征。

1 材料與方法

1.1 材料來源

粒度分析儀（NICOMP-380ZLS，美國PSS）；熒光分光分度計（RF-5301PC，日本島津）；準雙光束紫外可見分光光度計（UV-3802，尤尼柯（上海）儀器有限公司）；核磁共振造影劑馳豫率分析與成像系統（NM120，蘇州紐邁公司）；超聲波清洗器（XM-3200UVF，昆山禾創超聲儀器有限公司）；集熱式磁力攪拌器（DF-101S，上海力辰儀器科技有限公司）；萬分之一天平[QUINTIX65-1CN，賽多利斯（德國）集團]；熒光染料Cy5.5、pertuzumab 購自上海前衍生物科技有限公司；EDC-HCl、NHS 購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 方法

雙模態探針Gd-Cy5.5-pertuzumab 的制備包括DOTA-pertuzumab 的合成和Gd-Cy5.5-Pertuzumab的合成。

1.2.1 DOTA-pertuzumab 的合成 將2 mg pertuzumab稀釋在400 μl 無菌的PBS 中，加入0.1 M 碳酸氫鈉調節溶液pH 為8.4，加入40 mg p-SCN-Bn-DOTA，使pertuzumab 與p-SCN-Bn-DOTA 的摩爾比為1∶10[7-8]。溶液混合后在室溫下振蕩反應12 h。反應物用30kD 超濾管分離純化，除去未反應的p-SCNBn-DOTA，得到產物DOTA-pertuzumab，備用復合物-20℃保存。

1.2.2 Gd-Cy5.5-Pertuzumab 的合成 ①稱取GdCl3-6H2O 20 mg，溶于20 mL PBS 中，加入碳酸氫鈉溶液調節pH 為8.4。將此溶液與上述溶液混合反應6 h。最后用10 kD 超濾管超濾，除去未反應的GdCl3-6H2O，得到產物Gd-DOTA-pertuzumab，然后備用的復合物4℃保存。②稱取0.5 mgEDC 和0.5 mgNHS，加入上述產物中，在室溫下放于恒溫振蕩器上活化1 h，將活化的溶液與200 μg Cy5.5 熒光染料混合，測得pH 為8.4。然后在室溫下，搖床孵育2 h。反應結束后，用10kD 超濾管除去未反應的Cy5.5。得到產物Gd-Cy5.5-pertuzumab。用上述方法制作Gd-DOTA-Cy5.5 作為熒光成像對照組。

1.3 觀察指標

Gd-Cy5.5-Pertuzumab 的表征檢測包括透射電鏡尺寸的檢測、水動力尺寸及zeta 電位的測定、光學性質表征和弛豫率的測定。 ①透射電鏡尺寸的檢測：取適量Gd-Cy5.5-pertuzumab 溶液，用水作分散劑超聲探頭分散后，用滴管取一滴懸浮液滴于銅網上，干燥后，通過生物透射電鏡下觀察合成物的形態及粒徑大小。 ②水動力尺寸及zeta 電位的測定：取100 μl Gd-Cy5.5-pertuzumab 溶液，加入去離子水稀釋后，移入Eppendorf 管中，在超聲波清洗機中振蕩15 min，使得納米顆粒均勻分散，然后移入到比色皿中，通過動態光散射測量納米粒子的水動力尺寸和zeta 電位。 ③光學性質表征：各取Gd-Cy5.5-pertuzumab、Gd-DOTA-pertuzumab 溶液3 mL，移入石英比色皿中，用熒光檢測儀分別兩種樣品進行熒光成像。 ④弛豫率的測定：取適量納米探針溶液，用去離子水稀釋探針，得到不同濃度梯度的Gd:0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mM。將稀釋后的不同濃度的Gd 各取1 mL 放于Eppendorf 管，濃度由低到高標記為1、2、3、4、5 號。每次取一個置于紐邁小核磁分析儀中，磁體探頭選擇Meso60～60 mm，序列為IR。將1～5 號Eppendorf 置于試管架上，放于3.0MRI頭部線圈中，進行磁共振T1序列掃描。

2 結果

2.1 納米探針的表征

透射電鏡結果顯示，納米探針Gd-Cy5.5-pertuzumab 的形態為圓形，內部黑色顆粒為多個釓原子，周圍由pertuzumab 和Cy5.5 包裹呈現出球狀，大小較均勻，見圖1。Gd-Cy5.5-pertuzumab 水合粒徑尺寸為（133.17±11.14）nm，探針分布尺寸窄，分散性較好，見圖2。zeta 電位為（-34.58±7.91）mV，zeta 電位表明了合成物的穩定性，正值越大或負值越小說明越穩定。

圖1 Gd-Cy5.5-pertuzumab TEM

圖2 Gd-Cy5.5-pertuzumab 納米探針水合粒徑尺寸

2.2 Gd-DOTA-pertuzumab 和 Gd-Cy5.5-pertuzumab 熒光強度

探針在600 nm 處激發，685 nm 處有明顯吸收峰，與熒光染料Cy5.5 的發射波長一致，表明Cy5.5偶聯成功。而未偶聯熒光染料的Gd-DOTApertuzumab，沒有熒光信號，見圖3。

圖3 Gd-DOTA-pertuzumab 和Gd-Cy5.5-pertuzumab 熒光強度

2.3 Gd-Cy5.5-Pertuzumab 弛豫率

經3.0T 磁共振T1掃描顯示隨著Gd 濃度增加信號強度明顯增強，見圖4。運用紐邁小核磁檢測不同濃度的Gd-Cy5.5-Pertuzumab：0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mM 的T1時間。經OriginPro 2017 線性擬合得出，r1 的弛豫率為27.848 3 mM-1S-1，見圖5。

圖4 Gd-Cy5.5-pertuzumab 磁共振成像

圖5 Gd-Cy5.5-pertuzumab 弛豫率

3 討論

甲狀腺癌在我國發病率逐年升高、在內分泌系統腫瘤中越來越常見[9-10]。傳統的檢查方式（如X線、CT、超聲）具有一定的輻射損傷和滯后性[11]。而運用分子影像學的手段，能更有效反映活體狀態下組織、細胞水平的變化，并且可以對其生物學行為在影像方面進行定性、定量研究[12]。

目前，雙模態探針的制備在分子影像中逐步成為主流[13-14]。磁共振成像是診斷腫瘤最有效的分子影像學工具之一，具有高分辨率，無電離輻射等優點，釓劑是目前臨床上常用的、成熟的磁共振造影劑[15]，通常通過注入釓劑來改變病變組織信號，以達到檢測和診斷的目的。因此，實驗中以釓劑為磁共振成像材料，通過T1成像，增加腫瘤組織與正常組織之間的對比度[16-17]。熒光染料Cy5.5 具有較高的生物安全性、穩定性、熒光強度高，毒性低等特點。在小動物活體實驗時，利用小動物熒光成像有望代替有輻射性的核素成像。納米級分子探針在腫瘤中具有較好的滲透性和弛豫時間，可與腫瘤表面的受體特異性結合。研究表明，Her2 在甲狀腺未分化癌細胞8505C 中具有較高的表達，對甲狀腺腫瘤的良惡性診斷有一定意義[18-19]。實驗利用p-SCN-Bn-DOTA 雙功能螯合物，連接Gd、Cy5.5、pertuzumab，合成一種以Her2 為潛在靶點、具有磁共振和熒光雙模態特點的納米探針。據報道，有40%的未分化甲狀腺癌患者會發生頸部淋巴結轉移，因此研究一種新的雙模態探針檢測甲狀腺癌的早期病灶具有重要意義，利用帶有pertuzumab 的探針與病灶中的Her2 特異性結合，實現腫瘤靶向成像，從而能在疾病早期診斷出病變。本實驗中制備的Gd-Cy5.5-pertuzumab 雙模態探針具有良好的穩定性，其形態均勻、分散性良好。測得探針的粒徑大小為（133.17±11.14）nm，zeta 電位為（-34.58±7.91）mV，當zeta 電位小于-30 mV 時表明該納米探針就有較好的穩定性。通過紐邁小核磁和MRI 檢測出弛豫率為27.848 3 mM-1S-1，弛豫率高于傳統的Gd-DTPA（5.83 mM-1S-1）[20]，且探針隨濃度的增大T1信號強度也逐漸增高。

綜上所述，本實驗合成的磁共振/熒光雙模態探針Gd-Cy5.5-Pertuzumab，具有大小均勻、性質穩定的特點。該探針有望為甲狀腺癌早期診斷提供預警，并且可以為患者的治療方案提供指導。