高齡女性新鮮周期不同發(fā)育天數(shù)胚胎移植的臨床分析

王龍梅，邱乒乒，紀(jì)紅，姜雨飛，李萍

廈門大學(xué)附屬婦女兒童醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科（廈門市生殖與遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室），福建廈門 361003

隨著社會的發(fā)展，越來越多的女性推遲生育。研究表明女性生育力在32 歲時下降，在37 歲后下降的速度增加[1]。在先進(jìn)且日趨成熟的輔助生殖技術(shù)幫助下，高齡不孕患者有能力實(shí)現(xiàn)懷孕。然而，高齡是女性不孕癥和產(chǎn)科并發(fā)癥的危險因素[2-3]，患者在進(jìn)行不孕癥治療前應(yīng)充分了解和評估潛在的并發(fā)癥。女性年齡的增長伴隨著卵母細(xì)胞數(shù)量的減少及染色體異常的風(fēng)險增加[4-6]。大量研究表明，囊胚經(jīng)過了體外初步淘汰過程，移植后妊娠率較卵裂期胚胎顯著提高。不過囊胚在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)的時間較長，而較短時間的體外培養(yǎng)有利于降低外界環(huán)境對胚胎的影響，此外高齡女性獲卵數(shù)減少，一味追求囊胚移植可能會出現(xiàn)無可用胚胎周期取消的風(fēng)險。因此，為了提高移植率和臨床妊娠率，對于高齡患者，需要權(quán)衡利弊后選擇合適的移植時機(jī)。本文回顧性分析2017 年1 月—2021 年1月在廈門大學(xué)附屬婦女兒童醫(yī)院行新鮮胚胎移植，年齡≥35 歲的832 例患者資料，通過分析實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)及臨床結(jié)局，為高齡女性新鮮周期移植提供指導(dǎo)?，F(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析本院行新鮮胚胎移植患者832 例的臨床資料，按移植胚胎的發(fā)育天數(shù)分為D2 移植組（113 例），D3 移植組（685 例），D5 囊胚移植組（34例）。所需數(shù)據(jù)來源于廈門大學(xué)附屬婦女兒童醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科電子病歷系統(tǒng)。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：女性年齡≥35 歲；行新鮮胚胎移植的體外受精（in vitro fertilization, IVF）助孕患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：囊胚移植前行囊胚活檢者；接受供卵。

1.3 方法

1.3.1 促排卵及取卵 綜合評估患者不孕原因及卵巢儲備情況，制訂合適的促排卵用藥方案。根據(jù)陰道B 超監(jiān)測卵泡發(fā)育情況及抽血查血清雌二醇（estradiol, E2）、黃體生成素（luteinizing hormone, LH）上升情況，個性化調(diào)整促性腺激素劑量和種類。當(dāng)目標(biāo)卵泡的直徑達(dá)到18～20 mm 時注射重組人絨毛膜促性腺激素（艾澤，注冊證號S20130091），36 h 后陰道超聲取卵，獲得的卵冠丘復(fù)合物（oocyte corona cumulus complex, OCCs）用配子緩沖液洗滌后置于受精培養(yǎng)液中，37.0℃，6%CO2培養(yǎng)。

1.3.2 體外培養(yǎng)及胚胎評估 男方精液液化后，根據(jù)精子濃度及活力選擇密度梯度離心法或直接離心法優(yōu)選處理，置于36.0℃，6%CO2培養(yǎng)箱。根據(jù)精液質(zhì)量或既往體外受精（in vitro fertilization, IVF）助孕史選擇合適的方式進(jìn)行授精。

授精后16～18 h 進(jìn)行原核觀察，胞漿中有2 個原核為正常受精。授精后（44±1）h 和（68±1）h 進(jìn)行D2及D3 胚胎觀察，根據(jù)卵裂球數(shù)目、均勻程度，碎片、細(xì)胞核情況及其他異常情況（如胞質(zhì)粗糙、空泡等）進(jìn)行胚胎質(zhì)量評估。D3 發(fā)育至7～9 個細(xì)胞，卵裂球大小較均勻，細(xì)胞質(zhì)均一、無大空泡，無多核現(xiàn)象，碎片低于20%，為優(yōu)質(zhì)胚胎。D3 發(fā)育至6～12 個細(xì)胞，無多核現(xiàn)象，碎片低于30%，為可用胚胎。胚胎評估為1～3 級者均為可用胚胎，1～2 級為優(yōu)質(zhì)胚胎。D5 胚胎觀察在受精后（116±2）h 進(jìn)行，根據(jù)囊胚擴(kuò)張程度、內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（inner cell mass, ICM）及外滋養(yǎng)層（trophectoderm, TE）細(xì)胞數(shù)目及形態(tài)學(xué)進(jìn)行評估。按照囊胚腔擴(kuò)張程度分成1～6 期，根據(jù)ICM 和TE 細(xì)胞數(shù)分為A、B、C共3 個等級。3 期及以上囊胚，ICM 評級B 級以上(AA/BA/AB/BB/BC)為可用囊胚，其中ICM 及TE 評級為AA/BA/AB/BB 為優(yōu)質(zhì)囊胚。胚胎培養(yǎng)室的環(huán)境維持在室溫24～26℃，濕度40～60%。胚胎培養(yǎng)液均用礦物油覆蓋，放置于37℃，5%O2和6%CO2培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3.3 胚胎移植 新鮮胚胎移植一般在取卵后第3 日（D3）進(jìn)行，如果行囊胚培養(yǎng)，則在第5 日（D5）移植。第2 天可用胚≤2 枚可選擇在第2 日（D2）進(jìn)行胚胎移植。腹部B 超引導(dǎo)下進(jìn)行胚胎移植，術(shù)后即給予陰道用黃體酮陰道緩釋凝膠（雪諾同，注冊證號H20140552）1 支進(jìn)行黃體支持。

1.3.4 臨床隨訪判斷 胚胎移植后第13、15 天化驗(yàn)血清中β 絨毛膜促性腺激素（β-human chorionic gonadotropin, β-hCG），若β-hCG≥10 mIU/mL，則為生化妊娠。隔日復(fù)查翻倍良好，于移植術(shù)后的第4～6周陰道超聲檢查有孕囊或見胎心搏動則為臨床妊娠。孕12 周內(nèi)自然流產(chǎn)視為早期流產(chǎn)。分娩活胎者視為活產(chǎn)。

1.4 觀察指標(biāo)

（1）比較3 組患者的基礎(chǔ)資料，包括：年齡、體質(zhì)指數(shù)（body mass index, BMI）、不孕年限、基礎(chǔ)卵泡刺激素（basal fsh level, bFSH）、抗苗勒管激素（anti-Müllerian hormone, AMH）、竇卵泡數(shù)（antral follicle count, AFC）。

（2）比較3 組患者的促排卵及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)，包括：促性腺激素（gonadotropins, Gn）的使用天數(shù)、Gn劑量、獲卵數(shù)、2PN 受精率、可用胚數(shù)、優(yōu)胚數(shù)、平均移植胚胎數(shù)。

（3）比較3 組患者的生化妊娠率、臨床妊娠率、多胎率、早期流產(chǎn)率及活產(chǎn)率，計(jì)算公式如下。

①生化妊娠率=生化妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%；②臨床妊娠率=臨床妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%；③多胎率=≥2 個孕囊的妊娠周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%；④早期流產(chǎn)率=孕12 周內(nèi)流產(chǎn)周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%；⑤活產(chǎn)率=分娩活胎周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

采用IBM SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料不符合正態(tài)分布者，采用中位數(shù)M（P25，P75）描述，使用K-W 檢驗(yàn)進(jìn)行比較；計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)和百分比（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)。以是否臨床妊娠作為因變量，單因素分析具有意義或結(jié)合臨床有意義的指標(biāo)作為自變量，采用二元Logistic 回歸模型輸入法對影響臨床結(jié)局的因素進(jìn)行分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3 組患者一般資料比較

D2 移植組的年齡、bFSH 在3 組中最高，AMH、AFC 在3 組中最低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。D5 移植組的年齡、bFSH 在3 組中最低，AMH、AFC在3 組 中 最 高，差 異 有 統(tǒng) 計(jì) 學(xué) 意 義（P＜0.05）。見表1。

表1 3 組患者一般資料比較[M（P25，P75）]

2.2 3 組患者促排卵及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較

D2 移植組的獲卵數(shù)、可用胚、優(yōu)胚數(shù)在3 組中最低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），D5 移植組的獲卵數(shù)、可用胚數(shù)、優(yōu)胚數(shù)在3 組中最高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；D3 移植組與D5 移植組的Gn 天數(shù)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；D3 移植組的平均移植胚胎數(shù)在3 組中最高，D5 移植組最低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；3 組間Gn 劑量、2PN 受精率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 3 組促排卵及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)(±s)

表2 3 組促排卵及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)(±s)

注：與D2 移植組比較，※P＜0.05；與D3 移植組比較，#P＜0.05

組別D2 移植（n=113）D3 移植（n=685）D5 移植（n=34）F 值P 值Gn 天數(shù)（d）9.7±0.2 9.6±0.1（10.2±0.2）#6.684 0.035 Gn 劑量（IU）2 730.3±58.9 2 787.5±24.7 2 719.5±106.6 0.925 0.630獲卵數(shù)（個）（4.1±0.3）#（7.9±0.1）※（11.3±0.9）※#126.526＜0.001 2PN 受精率（%）69.9±0.03 75.7±0.01 75.6±0.03 2.725 0.256可用胚數(shù)（個）（2.0±0.1）# （4.6±0.1）※ （7.0±0.6）※#133.566＜0.001優(yōu)胚數(shù)（個）（0.7±0.1）#（1.4±0.1）※ （2.9±0.4）※#37.890＜0.001平均移植胚胎數(shù)（枚）（1.6±0.04）# （1.8±0.02）※ （1.2±0.07）※#83.387＜0.001

2.3 3 組患者臨床結(jié)局比較

D2 移植組的臨床妊娠率及活產(chǎn)率在3 組中最低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；D5 移植組的臨床妊娠率及活產(chǎn)率在3 組中最高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 3 組患者臨床結(jié)局比較（%）

2.4 胚胎移植臨床結(jié)局的Logistic 回歸分析

移植胚胎的D5 移植、年齡以及移植胚胎數(shù)是影響臨床妊娠的獨(dú)立影響因素（P＜0.05）。見表4。

表4 影響不同發(fā)育天數(shù)胚胎移植臨床結(jié)局的二元Logistic 回歸分析

3 討論

近幾十年來，婦女推遲生育已經(jīng)成為一個世界性的問題。輔助生殖技術(shù)在高齡產(chǎn)婦中的應(yīng)用日益增多。研究表明，隨著母體年齡的增長，與減數(shù)分裂相關(guān)的卵母細(xì)胞非整倍體的發(fā)生率顯著增加[7-9]。在輔助生殖技術(shù)中，IVF 周期活產(chǎn)率與母親年齡直接相關(guān)。美國疾病控制與預(yù)防中心最近的數(shù)據(jù)顯示，2017年所有新鮮的、非捐贈者體外受精周期，＜35 歲女性的活產(chǎn)率為51.6%，這一比例隨著女性年齡的增長而下降：35～37 歲為37.5%，38～40 歲時為23.5%，41～42歲時為11.8%，而≥43歲的女性不到3.4%[10]。

在體外受精與胚胎移植（in vitro fertilization and embryo transfer, IVF-ET）技術(shù)中，多胚胎移植可增加活產(chǎn)的可能性。然而，多胎妊娠的風(fēng)險也會增加，并伴有一系列嚴(yán)重的母嬰并發(fā)癥[11-12]。單個胚胎移植是減少多胎妊娠最直接的方法。近年來，囊胚培養(yǎng)和移植已廣泛應(yīng)用于大多數(shù)生殖中心。胚胎培養(yǎng)基優(yōu)化以及培養(yǎng)技術(shù)的成熟為從卵裂期胚胎移植到囊胚期移植地轉(zhuǎn)變提供了技術(shù)支撐。囊胚培養(yǎng)的基本原理是通過延長體外培養(yǎng)時間來進(jìn)一步篩選更具發(fā)育潛力的胚胎，進(jìn)一步排除具有遺傳缺陷和高頻率的非整倍體胚胎[13-14]。同時，囊胚與子宮內(nèi)膜同步性更好，可減少異位妊娠[15-17]，使單個囊胚移植成為了在保持臨床妊娠率的同時減少多胎妊娠的一種潛在有效方法。

本研究提示，與D2 和D3 移植相比，D5 囊胚移植是移植的首選。Sainte-Rose R 等[18]的最新研究報告也表明，體外延長培養(yǎng)對高齡女性是有利的。然而，囊胚培養(yǎng)并不適合所有患者[19]。對于獲卵數(shù)少或可用胚數(shù)少的高齡患者，繼續(xù)培養(yǎng)至D3 或者囊胚將有可能導(dǎo)致無可用胚、周期取消的風(fēng)險。當(dāng)前的挑戰(zhàn)是如何前瞻性地選擇合適的患者進(jìn)行囊胚培養(yǎng)計(jì)劃，以及對于每個患者來說，與卵裂期移植相比，這項(xiàng)技術(shù)是否會增加活產(chǎn)健康嬰兒的可能性[20]。

本中心對于新鮮周期D2 天可用胚≤2 枚的患者采取的是D2 移植1～2 枚可用胚。對于大多數(shù)高齡女性主要是選取1～2 枚D3 胚移植。若D3 天胚胎數(shù)較多，則主要采取的是延長培養(yǎng)，移植1 枚D5 囊胚。本研究中D2 移植的臨床妊娠率最低為30.09%，D5移植的臨床妊娠率最高58.82%，Demián G 等[19]關(guān)于27 項(xiàng)RCT 研究報告也表明，新鮮囊胚移植后臨床妊娠率顯著升高（OR=1.30；95%CI:1.14～1.47；day 2～3:37.2%；day 5～6:43.2%；I2=56%），同時該報告指出使用新鮮卵裂期胚胎移植具有29%的活產(chǎn)率，而使用新鮮囊胚移植活產(chǎn)率為32%～42%，本文中D2、D3 和D5 移植的活產(chǎn)率分別是18.58%、33.28%和44.12%，兩者的結(jié)果較為一致。Yang L 等[21]采用Time-lapse模型篩選單個D3 天胚胎移植與采用傳統(tǒng)形態(tài)選擇的單個D5 移植的持續(xù)妊娠率進(jìn)行比較，結(jié)果顯示D3 天的持續(xù)妊娠率顯著低于D5 天，說明如果移植的胚胎數(shù)量一致，質(zhì)量良好的囊胚與卵裂期胚胎相比，具有更高的臨床妊娠率和活產(chǎn)率。

綜上所述，胚胎的數(shù)量和質(zhì)量是高齡女性選擇移植時機(jī)的重要考慮標(biāo)準(zhǔn)。對于高齡女性，延長培養(yǎng)至囊胚階段，進(jìn)行D5 囊胚移植，可獲得較高的臨床妊娠率以及活產(chǎn)率。對于獲卵數(shù)少，或可用胚少的患者，為患者爭取移植機(jī)會，避免出現(xiàn)無可用胚胎周期取消的情況，選擇D2 移植亦可獲得一定的臨床妊娠率及活產(chǎn)率。