阿司匹林抵抗和缺血性腦卒中的相關(guān)性研究

李植燦，姚慶陽，王燦明，黃清宇

福建省泉州市第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，福建泉州 362000

缺血性腦卒中在中老年人群中是一種發(fā)病率較高的腦血管疾病[1]。該病發(fā)作突然，病情進(jìn)展快速，如不及時(shí)治療，可引起患者殘疾或死亡。目前臨床上主要通過抗血小板藥物對該病進(jìn)行治療，可有效控制缺血性腦卒中患者的病情進(jìn)展。阿司匹林是一種常用的抗血小板藥物，但近些年來隨著該藥物的廣泛的應(yīng)用，有調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，部分患者服用阿司匹林后無法有效降低缺血性腦卒中復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)指出這可能與阿司匹林抵抗（aspirin resistance, AR）現(xiàn)象有關(guān)[2]。近些年來隨著基因技術(shù)的發(fā)展進(jìn)步，有研究發(fā)現(xiàn)，阿司匹林是一種非選擇性環(huán)氧合酶（cyclooxygenase, COX）抑制劑，能與COX進(jìn)行反應(yīng)使酶失去活性，從而對花生四烯酸（arachidonic acid, AA）進(jìn)行有效抑制，使血小板在血栓素A2（thromboxaneA2, TXA2）介導(dǎo)下發(fā)生的聚集現(xiàn)象被阻斷[3]。阿司匹林能不可逆地抑制COX-1 與COX-2，但對COX-1 具有更強(qiáng)的抑制效果，因此，其對COX-1 的抑制程度在很大程度上決定了其抗栓效果。近些年隨著對COX 基因多態(tài)性研究的深入，有研究指出AR 現(xiàn)象可能與COX-1 受體上-1676A＞G 及COX-2 基因啟動(dòng)子區(qū)的-765G/C 多態(tài)性有關(guān)[4]?；诖?，本文方便選取2018 年1 月—2020 年9 月在泉州市第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院的258 例缺血性腦卒中患者為研究對象，對其AR 與缺血性腦卒中之間的相關(guān)性進(jìn)行了研究分析，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

方便選取于本院神經(jīng)內(nèi)科住院的258 例缺血性腦卒中患者為研究對象，所有患者入院后均進(jìn)行磁共振檢查發(fā)現(xiàn)新的腦梗死病灶，并根據(jù)GUM標(biāo)準(zhǔn)：采用10 μmol/L 二磷酸腺苷（adenosine diphosphate, ADP）對血小板進(jìn)行誘導(dǎo)，AS 為血小板聚集率＜70%，AR 為血小板聚集率≥70%。其中，AS 組170 例，AR 組88 例。阿司匹林敏感（Aspirin sensitivity, AS）組中男105 例，女65 例；年齡49～79 歲，平均（65.24±3.87）歲；體質(zhì)指數(shù)（body mass index, BMI）19.89～32.14 kg/m2，平均（25.99±3.05）kg/m2；吸煙患者66 例，不吸煙患者104 例；高血壓病患者104 例（61.18%）；糖尿病患者58 例（34.12%）。AR 組中男58 例，女30 例；年齡51～80 歲，平均（66.08±3.91）歲；BMI 20.13～32.89 kg/m2，平均（26.11±3.09）kg/m2；吸煙患者34 例，不吸煙患者54 例；高血壓病患者55例（62.5%）；糖尿病患者24 例（27.27%）。兩組患者基本臨床資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究通過本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡49～80 歲者；②已簽署知情同意書者；③病情穩(wěn)定可控，精神狀態(tài)良好，能夠積極配合完成本次研究者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①各種原因，中途要求自動(dòng)退出者；②阿司匹林過敏者；③合并嚴(yán)重消化性潰瘍、出血者；④合并急慢性血液系統(tǒng)疾病者；⑤合并重癥高血壓、房顫者；⑥合并嚴(yán)重肝腎功能不全者；⑦近期合并腦出血、腦外傷及手術(shù)者；⑧長期酗酒者。

1.3 方法

①光比濁法測定血小板集聚率：抽取全血放置在枸櫞酸鈉抗凝管中，用以 500 r/min 的離心機(jī)，離心 5 min，提取上層富含血小板的血漿（platelet rich plasma, PRP）。將剩余血液標(biāo)本再次以3 000 r/min轉(zhuǎn)速離心 15 min，提取上層貧血小板血漿（platelet poor plasma, PPP），用作實(shí)驗(yàn)校正。200 μl PRP 放置在樣品方杯中，200 μlPPP 放置于校正方杯中，恒溫預(yù)熱3 min。儀器調(diào)至TEST 狀態(tài)，進(jìn)行儀器檢測零點(diǎn)校正，待數(shù)值穩(wěn)定后，往杯底加入10 μmol/L ADP 5μl，進(jìn)行血小板聚集率測試。據(jù)GUM 標(biāo)準(zhǔn)：用10 μmol/L ADP 誘導(dǎo)的血小板聚集率≥70%定義為AR，血小板聚集率＜70%定義為阿司匹林敏感。

②DNA 提取：提取晨起空腹患者靜脈血2 mL，放置保存在枸櫞酸鈉抗凝管中，用DNA 提取試劑盒提取全血中的DNA，并于-20℃環(huán)境下進(jìn)行保存。

③聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction,PCR）及DNA 測序：首先從把COX-1、COX-2 基因變異位點(diǎn)從HapMap 中國漢族人群數(shù)據(jù)庫中提取出來。以0.05 為最小等位基因頻率（minor allele frequency, MAF）下限，利用獲取的變異位點(diǎn)以r2＞0.8原則對tag SNP 進(jìn)行鑒別挑選。對COX-1 -1676A＞G 引物、COX-2 上765G/C 引物進(jìn)行擴(kuò)增處理。完成后對PCR 產(chǎn)物進(jìn)行DNA 測序檢測。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)和百分率（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。另使用Pearon Chi-Square 對基因型及表型進(jìn)行檢測，之后使用Hapviewer 軟件對基因位點(diǎn)是否出現(xiàn)連鎖不平衡現(xiàn)象進(jìn)行計(jì)算。

2 結(jié)果

2.1 兩組Hard-Weinberg 平衡檢驗(yàn)

258 例患者血液DNA 檢測結(jié)果顯示，在COX-1 -1676A＞G 位點(diǎn)中，AA 純合子、AG 雜合子、GG 突變 純合 子 分 別 為90 例、131 例、37 例；在COX-2-765G/C 位點(diǎn)中，GG 純合子、GC 雜合子分別為221例、37 例，CC 突變純合子未發(fā)現(xiàn)。COX-1 -1676A＞G 及COX-2 -765G/C 等位基因頻率分別符合Hard-Weinberg 平衡檢驗(yàn)，樣本有廣泛代表性。見表1。

表1 所選位點(diǎn)的基因型頻率分布及Hard-Weinberg 平衡檢驗(yàn)Table 1 Genotype frequency distribution and Hard-Weinberg equilibrium test for selected loci

2.2 兩 組 患 者COX-1 -1676A＞G 及COX-2-765G/C 位點(diǎn)基因型分布比較

AS 組與AR 組COX-1 -1676A＞G 位點(diǎn)G 等位基因攜帶及COX-2 -765G/C 位點(diǎn)C 等位基因攜帶相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 兩組患者COX-1 -1676A＞G 及COX-2 -765G/C 位點(diǎn)基因型分布對比[n(%)]Table 2 Comparison of genotype distribution of COX-1 -1676A＞G and COX-2 -765G/C loci between the two groups of patients[n(%)]

2.3 兩組患者終點(diǎn)事件發(fā)生率比較

兩組258 例患者共出現(xiàn)42 例終點(diǎn)事件，占比16.28%。 其 中 死 亡3 例（1.16%），腦 出 血5 例（1.94%），心肌梗死3 例（1.16%），缺血性腦卒中復(fù)發(fā)31 例（12.02%）。其中，AR 組缺血性腦卒中復(fù)發(fā)率明顯高于AS 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 兩組終點(diǎn)事件發(fā)生率對比[n(%)]Table 3 Comparison of the incidence of end-point events between the two groups[n(%)]

2.4 兩組患者臨床預(yù)后與COX-1-1676A＞G、COX-2-765G/C 基因型相關(guān)性分析

COX-1-1676A＞G 其G 等位基因攜帶和缺血性腦卒中復(fù)發(fā)相比存在相關(guān)性（OR=0.28，95%CI=0.05～2.31，P＜0.05）；COX-2-765G/C 其C 等位基因攜帶與缺血性腦卒中復(fù)發(fā)均無相關(guān)性（OR=5.71，95%CI=1.11～29.55，P＞0.05）。見表4。

表4 兩組患者臨床預(yù)后與COX-1 -1676A＞G、COX-2 -765G/C基因型相關(guān)性分析Table 4 Correlation analysis between clinical prognosis and COX-1-1676A ＞G and COX-2-765g /C genotypes in the two groups

3 討論

本研究結(jié)果顯示：AR 組缺血性腦卒中復(fù)發(fā)率明顯高于AS 組（P＜0.05），提示缺血性腦卒中復(fù)發(fā)與AR 存在密切聯(lián)系。近些年來基因技術(shù)的重大突破，為臨床相關(guān)方面的研究開辟了一條新途徑，即從分子流行病學(xué)角度對心腦血管疾病與基因變異之間存在的聯(lián)系進(jìn)行研究，并且已有研究在某些方面已經(jīng)證實(shí)AR 與遺傳的基因易感性存在密切聯(lián)系[5-6]。因此對人群中的AR 易感性基因進(jìn)行篩查可指導(dǎo)和幫助臨床上更好地識(shí)別和防治高危人群。AR 具有較為復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制，且肥胖、吸煙等內(nèi)外多種因素均會(huì)對其發(fā)生產(chǎn)生影響，其作用機(jī)制主要是通過對患者基線狀態(tài)下血小板活性產(chǎn)生影響，從而對抗血小板治療反應(yīng)性進(jìn)行影響。而本研究納入的兩組患者的臨床基本資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），因此，在本研究中可以將基線狀態(tài)下混雜因素對阿司匹林敏感性的干擾排除，所以本文主要對阿司匹林治療效果與COX-1、COX-2 基因之間存在的關(guān)系進(jìn)行研究分析。

目前國內(nèi)外并無統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)來檢測AR，主要有：血栓彈力圖檢測、電阻抗聚集度法測定、光比濁法測定、血小板功能分析儀、出血時(shí)間測定、血清TXA2 及其代謝物含量測定法、Verify Now 系統(tǒng)等[7]。但這些方法都各有利弊，在一定程度上會(huì)受到特異性和/或敏感性方面的固有的偏差影響。根據(jù)國內(nèi)外的一些報(bào)告，不同的檢測方法，其AR 的發(fā)生率在5%～60%之間[8]。本研究通過光比濁法測定發(fā)現(xiàn)AR 的發(fā)生率為34.1%。

本研究結(jié)果顯示AR 組COX-1-1676A＞G 位點(diǎn)G 等位基因攜帶頻率達(dá)71.59%，高于AS 組的61.76%，但兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；對258 例患者進(jìn)行隨訪發(fā)現(xiàn)腦梗死復(fù)發(fā)的患者中GA+GG 基因型頻率達(dá)87.1%，未復(fù)發(fā)組達(dá)62.1%，且COX-1-1676A＞G 其G 等位基因攜帶和缺血性腦卒中復(fù)發(fā)之間存在相關(guān)性（OR=0.28，95%CI=0.05～2.31，P＜0.05）。這一研究結(jié)果與張萃藝等[9]的研究相一致，服用阿司匹林但仍發(fā)生腦缺血性事件的概率達(dá)到70.23%，與由于1676A＞G 基因突變型存在明顯相關(guān)性（OR=0.26），并提出這可能是1676A＞G 攜帶的G 等位基因提高COX-1 RNA 的表達(dá)，增加蛋白質(zhì)的合成，促進(jìn)TXA2 的合成，促使血小板大量聚集形成血栓。根本原因是COX-1-1676A＞G 基因在中國漢族人群中比較常見，在我國心腦血管疾病患者中阿司匹林耐藥性與COX-1 基因-1676A＞G 攜帶的G 等位基因變異體密切相關(guān)[10]。李虓等[11]通過調(diào)查431 例服用阿司匹林的老年漢族心腦血管疾病患者的COX-1 基因中單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)（single nucleotide polymorphisms, SNP）與AR 的關(guān)聯(lián)性，發(fā)現(xiàn)COX-1 基因-1676A＞G 攜帶的G 等位基因可增加AR 的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。但有研究發(fā)現(xiàn)，AR 的發(fā)生與COX-1 基因-1676A＞G 攜帶的G 等位基因不相關(guān)。李霞等[12]研究發(fā)現(xiàn)，COX-1 基因-1676A＞G 攜帶的G 等位基因并未增加AR 的發(fā)生，未增高缺血性腦卒中的復(fù)發(fā)率。

COX-2 基因位于1 號染色體上，與COX-1 相比，COX-2 主要在炎癥反應(yīng)中起作用[13]，可將AA 轉(zhuǎn)化成TXA2，從而促進(jìn)血小板聚集。有報(bào)告認(rèn)為COX-2-765C 等位基因的突變可能降低阿司匹林的敏感性而造成AR[14]。袁凌[15]通過對450 例缺血性卒中患者進(jìn)行3 個(gè)月隨訪觀察，發(fā)現(xiàn)攜帶COX-2-765C 等位基因的患者AR 的發(fā)生率更高，其預(yù)后不良。但楊秀峰等[16]研究發(fā)現(xiàn)COX-2-765G/C 突變基因型并未增加缺血性腦卒中及心肌梗死的風(fēng)險(xiǎn)。本研究結(jié)果顯示：AS 組COX-2-765G/C 基因攜帶C等位基因的頻率為11.18%，與其相比，AR組COX-2-765G/C基因攜帶C等位基因的頻率更高（20.46%）；對比AS組患者發(fā)生腦梗死（8.82%），AR 組更容易發(fā)生腦梗死（18.18%）（P＜0.05）。

綜上所述，本研究顯示AR 與缺血性腦卒中復(fù)發(fā)明顯相關(guān)，但是未來還需要對缺血性腦卒中患者發(fā)生AR 與COX-2-765G/C 基因及COX-1-1676A＞G基因之間的相關(guān)性進(jìn)行進(jìn)一步研究，并且可以選取其他SNP 位點(diǎn)作為研究對象，從而對AR 的基因變異特性進(jìn)行更加全面的了解，進(jìn)而為臨床治療提供借鑒和參考。