纖維素酶處理玉米秸稈對NDF與ADF及乳酸菌數量的影響

牛彥波，安 琦，原 韜，曹亞彬

(黑龍江省科學院微生物研究所，哈爾濱 150010)

玉米是黑龍江省的主要農作物，其產量居于全省第一。年種植玉米面積近667萬hm2[1]，因此每年玉米秸稈的產量較大。玉米秸稈在自然狀態下營養價值很低，粗纖維含量高，消化率低，適口性差，作為牲畜的粗飼料品質不佳，飼喂營養價值較低，動物對秸稈采食量低。然而，玉米秸稈黃貯能夠降低粗纖維的含量，改善其適口性，從而促進動物采食，提高秸稈飼料化的利用率。研究表明，黃貯可以保留秸稈中85%的養分，令秸稈多汁，柔軟，適口性更佳。黃貯秸稈比干秸稈更能刺激反芻動物的食欲，促進其消化腺分泌，令反芻動物飼料采食速度和采食量分別提高43%、20%[2]。玉米秸稈黃貯添加酶制劑是近年來的研究熱點。纖維素酶能將植物中的纖維素降解，變為更容易被動物消化的單糖物質，從而提高粗飼料的營養價值，因而纖維素酶的應用越來越廣泛。添加纖維素酶后，植物細胞壁被分解，產生的碳水化合物給乳酸菌發酵提供底物，產生乳酸，不斷促進秸稈發酵。1993年，趙長友等[3]研究發現，添加纖維素酶可以改善黃貯飼料的發酵品質，提高營養成分，抑制霉菌生長，防止腐敗，提高窖貯的完好率。薛艷林等[4]報道，纖維素酶制劑處理黃貯小麥，可以顯著降低黃貯飼料的pH值及ADF、NDF、氨態氮含量，還顯著提高了LA、揮發性脂肪酸和CP的含量。但是，目前關于黃貯玉米秸稈中添加纖維素酶的效果結果并不一致，原因可能有多種，如玉米秸稈種類的差異、酶種類的差異、酶活標記不準確、黃貯時間及方式不統一等。酶制劑的應用也受到了應用條件的制約，其中溫度的影響至關重要。低溫條件下，酶解效果會受到嚴重影響，所以在應用上存在問題。利用纖維素酶降解玉米秸稈中的粗纖維水平，通過測定不同黃貯階段NDF、ADF和乳酸菌的變化來驗證纖維素酶在玉米秸稈降解中的作用。

1 材料

酶制劑：諾維信液體酶制劑，酶活10 000 U/g。玉米秸稈：由市場購買。MRS固體培養基配方：蛋白胨 10.0 g、牛肉膏 5.0 g、葡萄糖20.0 g、酵母粉 4.0 g、乙酸鈉5.0 g、磷酸氫二鉀2.0 g、硫酸鎂 0.2 g、檸檬酸三銨 2.0 g、硫酸錳0.05 g、吐溫80 1 mL、瓊脂粉18 g、水1 000 ml ，pH 6.2±0.2，121℃20 min滅菌。

2 試驗方法與內容

2.1 試驗方法

玉米秸稈的處理方法：在自然風干后碾碎，用鍘刀將其切短到 2～4 cm ，再用粉碎機粉碎至1～0.5 cm。玉米秸稈黃貯時使用2～4 cm的干秸稈。干秸稈的水分含量小于10%。

酶液的處理：取原酶液10 mL，加入到90 mL純凈水中，為含酶量10%的稀釋酶液，混勻備用。

測定方法：活菌數的測定采用稀釋平板法；中性洗滌纖維(NDF)、酸性洗滌纖維(ADF)依照Van Soest等方法進行測定。

數據分析：采用Excel97-2003和SPSS Statistics 17.0數據分析軟件對試驗數據進行分析處理。

2.2 試驗內容

2.2.1 溫度對纖維素酶水解玉米秸稈的影響

采用減重法，將溫度設定為15℃、30℃、45℃，振蕩，pH自然，天數設定為5 d。將經過處理的干秸稈裝入濾袋中，每袋加入秸稈1 g左右，用塑封機封口，編號，待用。每克秸稈樣品中加入稀釋后的酶液0 uL、0.5 uL、2 uL、4 uL。每個處理3個重復。將各處理樣品裝入不同的燒杯中，按照試驗設計加入不同的酶液，補充水分至100 mL，放置于不同的環境中進行處理，5 d后將各樣品停止處理，用純凈水清洗，直至水無色為止，傾去純凈水，置于80℃烘箱中烘干至恒重。

2.2.2 不同黃貯時間及不同纖維素酶添加量對樣品NDF、ADF及乳酸菌的影響

每個處理秤取玉米秸稈500 g，按照酶的添加量共設計6組，每克干秸稈中加入0 ug、0.5 ug、5 ug、50 ug、500 ug的夏盛全組分纖維素酶，添加1 000 mL純凈水，混拌均勻，分裝于5個抽真空密封袋中，每個處理3個重復。溫度設定為常溫25℃～30℃，每15 d、30 d、45 d、60 d取樣測定。

3 結果與分析

3.1 溫度與纖維素酶添加量對玉米秸稈的影響

從表1溫度對纖維素酶水解玉米秸稈的試驗與數據分析結果中發現，低溫不利于纖維素酶的作用，與其他溫度條件下對比，在P<0.05水平，具有顯著性的差異；溫度并不是越高越能促進纖維素酶的酶解，45℃與30℃的秸稈失重率之間差異不顯著；研究發現在15℃的低溫條件下酶解的時間會延長，但與對照之間仍存在著較顯著的差異，秸稈粗纖維的降解率提高了0.5%以上，30℃和45℃與對照比存在著顯著的差異，30℃時秸稈粗纖維的降解率提高了3.3%以上，45℃時秸稈粗纖維的降解率提高了5.4%以上；但在水解試驗中發現，酶量增加并不與降解率呈現正相關性，數據分析顯示，酶量的多少對于玉米秸稈的粗纖維降解并沒有顯著的差異。在添加纖維素酶4.0 uL組，30℃時酶水解能力反而高于45℃時酶水解玉米秸稈的失重率，說明酶解并沒有隨著溫度的升高與酶量的增加而提高，反而表現出抑制反作用，所以用纖維素酶處理秸稈僅需要適量的酶量和必要的溫度，而無須高酶量和相對高溫條件。

表1 溫度、酶量對玉米秸稈粗纖維的影響Tab.1 Effect of temperature and cellulaseon on crude fiber of corn stalk

3.2 黃貯天數與纖維素酶不同添加量對NDF、ADF、乳酸菌活數的影響

表2的結果顯示了玉米秸稈在不同黃貯天數、不同纖維素酶添加酶量條件下，對NDF、ADF、與乳酸菌活菌數量的影響關系。

表2 纖維素酶不同添加量與秸稈黃貯天數對NDF、ADF與乳酸菌的影響Tab.2 Effect of cellulase of different additive amounts and yellow corn straw storage days on NDF, ADF and lactic acid bacteria

從數據分析結果來看，添加纖維素酶與不添加纖維素酶，玉米秸稈NDF與ADF有顯著性的差異，添加纖維素酶后，玉米秸稈NDF與ADF在各個處理組中均有明顯的降低。在第30 d的結果中，添加量達到5 ug/g、50 ug/g、500 ug/g的處理組，NDF均值分別從82.27%下降了4.87%、9.77%、26.30%，第45 d的時候，分別從81.93%下降了6.67%、11.67%、21.47%，第60 d時分別從82%下降了6.03%、10.40%、26.87%，隨著添加量的增加，降解率增加。從天數來看，最初的30 d，降幅明顯，第60 d時降幅變化不大，說明纖維素酶的作用與時間并不是正相關性的，它的作用是有時效性的，ADF的結果分析與NDF纖維素酶的作用能力基本一致；從不同天數與不同纖維素酶添加量對樣品中的乳酸菌影響來看，酶量的增加與時間對乳酸菌的數量均有顯著性差異，500 ug/g的處理組中，乳酸菌的活菌數量最高，第45 d以后活菌的數量達到了1.4×108cfu/g以上，超過同溫度下其他組別1～3個數量級。說明纖維素酶的添加有效地將秸稈中的大分子物質進行了降解，小分子糖類物質的增加促進了厭氧條件下乳酸菌的活性，在開袋時聞到了比對照更大的酸香味，從側面驗證了加入適量纖維素酶促進了秸稈發酵中產酸微生物群落的繁殖。

天數數據采用LSD 分析方法，在P<0.05時，*表示差異顯著。

4 討論

通過以上研究可以確定，在玉米秸稈黃貯過程中，添加纖維素酶能夠促進秸稈中粗纖維的降解，有利于產酸微生物乳酸菌的生長。隨著酶量的增加，NDF與ADF的下降幅度也在增加，但這種降幅與對照相比并不具有正相關性，隨著時間的延長，在45 d以后基本會處于穩定期，這應該與秸稈中營養成分的消耗有關系。如果隨著黃貯時間的再延長，同等條件下，添加纖維素的組別與不添加纖維素的組別之間的差距會縮小，但縮小的幅度還需進一步的驗考證。乳酸菌的數量隨著酶量增加呈遞增趨勢，與對照相比差距極顯著，數量增加了3個數量級。隨著黃貯的時間延長，在同酶量水平下變化不顯著，僅是同一數量級內的少量增加，這也符合微生物的生長曲線，在一定的階段處于穩定。但纖維素酶的添加對玉米秸稈黃貯過程中產酸微生物群落的貢獻是巨大的。干黃秸稈由于水分含量低，粗纖維含量高，微生物很難利用。在自然的黃貯狀態下，各類微生物需要漫長的過程進行代謝降解，黃貯時間長，降解效能低，加入纖維素酶之后，可以很快提高大分子物質的降解，促進微生物對小分子物質的利用，使其中的微生物快速繁殖，大大縮短了秸稈黃貯的時間，對秸稈的飼料化應用具有促進作用。