“拔伸松動法”對早中晚期膝骨性關節炎模型兔關節軟骨超微結構的影響

王春林 向勇 艾健 田啟東 胡鸞 趙志勇 王勇 董有康 張興宗 趙有強

摘要：目的 觀察拔伸松動手法對膝關節骨性關節炎（KOA）早中晚期模型兔膝關節軟骨超微結構的影響，探究拔伸松動法對KOA損傷軟骨的治療機制。方法 健康成年白兔90只，隨機分為3組，拔伸松動法組、模型組、空白組。每組10 只。采用Videman T 造模方法，管型石膏伸直位固定兔右后肢膝關節2、4、6 周，復制膝關節骨性關節炎早期、中期和晚期的模型。采用掃描電鏡、透射電鏡觀察軟骨細胞形態。結果 模型組兔膝關節軟骨細胞呈現細胞水腫，內質網溶解、線粒體固縮、細胞結構破裂、細胞固縮等改變;掃描電鏡觀察，模型組兔膝關節軟骨出現不同程度的軟骨表面不光滑、變性、破損，關節腔表面滲出物附著物等改變。經過拔伸松動法治療干預，早中晚期拔伸松動手法組兔膝關節軟骨細胞水腫程度、細胞結構破壞情況、軟骨表面形態、關節腔內滲出物情況較同期模型組均有改善，且以中期、晚期改善情況明顯。結論 拔伸松動手法可以延緩模型兔膝骨性關節炎所導致的關節軟骨損傷，對損傷的關節軟骨細胞具有修復作用。

關鍵詞：拔伸松動法;膝關節骨性關節炎;軟骨細胞超微結構

中圖分類號：R244.1?? 文獻標志碼：A?? 文章編號：1007-2349（2022）03-0067-05

Effect of Pulling-stretching-loosening Manipulation on the Ultrastructure of Articular Cartilage in Knee Osteoarthritis Model Rabbits in Early， Middle and Late Stages

WANG Chun-lin1， XIANG Yong1， AI Jian2， TIAN Qi-dong2， HU Luan2， ZHAO Zhi-yong2，WANG Yong2， DONG You-kang1， ZHANG Xing-zong2， ZHAO You-qiang1

（1. Yunnan University of Traditional Chinese Medicine， Kunming 650500， China;2. The First Affiliated Hospital of Yunnan University of Traditional Chinese Medicine， Kunming 650021， China）

【Abstract】Objective： To observe the effect of pulling-stretching-loosening manipulation on the ultrastructure of knee articular cartilage in knee osteoarthritis （KOA） model rabbits of early， middle and late stages and to explore the curative mechanism of pulling-stretching-loosening manipulation on KOA-damaged cartilage. Methods： 90 healthy adult white rabbits were randomly divided into 3 groups， the pulling-stretching-loosening manipulation group， the model group and the blank group， 10 rabbits per group. The Videman T modeling method was used to immobilize the knee joint of the right hind limb of the rabbit for 2， 4 and 6 weeks with cast plaster to replicate the early， middle and late stage models of knee osteoarthritis. The scanning electron microscope and transmission electron microscope were used to observe the morphology of chondrocytes. Results： The cartilage cells of the knee joint of the rabbits in the model group showed changes such as cell edema， endoplasmic reticulum dissolution， mitochondrial pyknosis， cell structure rupture and cell pyknosis. The scanning electron microscopy showed that the knee joint cartilage of the model group presented different degrees of uneven cartilage surface， degeneration， damage and exudate attachments in the joint cavity surface. After the intervention of pulling-stretching-loosening manipulation， the degree of edema， cell structure damage， cartilage surface morphology and exudate in the joint cavity of the rabbit knee joint in the early， middle and late stages of the pulling-stretching-loosening manipulation group were improved compared with the model group at the same period. The improvement was obvious in the middle and late stages. Conclusion： The pulling-stretching-loosening manipulations can delay the articular cartilage damage caused by the model rabbit knee osteoarthritis， and has a repairing effect on the damaged articular cartilage cells.

【Key words】Pulling-Stretching -Loosening Manipulation; Knee Osteoarthritis; Ultrastructure of Chondrocytes

膝關節骨性關節炎（knee osteoarthritis，KOA）是一種退行性骨關節疾病，其臨床癥狀主要為膝關節疼痛，活動受限，嚴重影響患者生活質量。隨著全球人口老齡化的進展，KOA的發病也呈上升趨勢。近年來筆者采用拔伸松動法治療KOA取得較好的臨床療效。關節軟骨的退變，軟骨細胞凋零是其發生過程的基本病理改變和原因[1]。本研究通過實驗性兔KOA早中晚期模型，觀察拔伸松動法治療對關節軟骨超微結構及軟骨細胞凋亡情況的影響，探討拔伸松動法對KOA關節軟骨的保護作用和軟骨細胞修復的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康成年白兔90只，體重（1.8～2.5）kg，雌雄不限，重量分布均一。實驗動物由云南中醫學院動物實驗中心提供。隨機分為3組，每組10只：拔伸松動法組、模型組、空白組。穩定飼養7 d后，采取Videman T的造模方法制作兔膝骨性關節炎模型。飼養于IVC動物實驗室，溫度20℃～25℃（日溫差≤3℃）;濕度40%～70%;照明12 h∶12 h明暗交替，照度150～300 Lx;噪音≤60 dB。本次實驗分3個階段進行，采用Videman T造模方法，管型石膏伸直位固定兔右后肢膝關節2、4、6周，復制KOA早期、中期和晚期的模型。

1.2 干預方法

1.2.1 拔伸松動法組 （1）屈伸患膝關節15次。（2）拔伸法施以患膝10 s后放松，然后在拔伸下分別以小魚際固定于膝關節下緣之內側和外側，向對側推按10次（外側向內側，內側向外側）。（3）五指提拿髕骨10次，順時針和逆時針活動髕骨10次。（4）上下左右推動髕骨各10次。（5）屈伸患膝關節15次。（6）拔伸患膝10 s，在拔伸過程中作膝關節小幅度內旋和外旋運動。每次10 min，隔日治療1次，治療20次后取標本。

1.2.2 模型組 造模后正常飼養，不采取干預措施，與拔伸松動法組同時取標本。

1.2.3 空白組 不予造模，正常飼養，不采取干預措施，與上2組同時取標本。

1.3 取材檢測 所有動物于實驗結束后1 d取材。耳緣靜脈注射空氣20 mL栓塞處死，切開右膝關節前中區滑膜組織，以矢狀位切取脛骨內側軟骨，取出軟骨組織，空置于脫酶處理的EP管內，液氮轉移至-80℃冰箱保存備用。以0.1 mol二甲砷酸鈉緩沖液漂洗標本，在1%四氧化鋨中固定2 h后，再次以0.1 mol二甲砷酸納緩沖液漂洗，乙醇逐級脫水后于醋酸異戊醋保存過夜，后以二氧化碳臨界點干燥，將其定向黏附于載物臺上，真空噴金，后通過掃描電鏡進行觀察。

2 實驗結果

2.1 透射電鏡 通過透射電鏡觀察關節軟骨的形態變化，可以看到空白組軟骨細胞未出現水腫、胞質內有豐富的內質網及高爾基體，線粒體較少，細胞核完整，胞膜結構完整（見圖1.1A）。早期模型組軟骨細胞出現輕度水腫，內質網部分輕度擴張，線粒體未見明顯異常，胞質內有豐富高爾基體，細胞結構正常，細胞核未見異常（見圖1.1B）。中期模型組軟骨細胞出現輕度水腫，內質網部分少量擴張，線粒體輕度腫脹，胞質內有豐富高爾基體、微絲水腫，細胞結構完整，細胞核未見異常（見圖1.1C）。晚期模型組軟骨細胞出現明顯水腫，內質網溶解，線粒體固縮，胞質內少見高爾基體、微絲水腫、有大量脂質溶解，細胞結構破裂，細胞固縮（見圖1.1D）。早期干預組軟骨細胞出現明顯水腫，內質網線粒體明顯減少，胞質內少見高爾基體、微絲水腫，細胞結構正常，細胞核未見明顯異常（見圖1.1E）。中期干預組軟骨細胞出現輕度水腫，內質網、線粒體較少，胞質內少見高爾基體、微絲水腫，細胞結構正常，細胞核未見異常（見圖1.1F）。晚期干預組軟骨細胞出現局部輕度水腫，內質網、線粒體未見明顯異常，胞質內有豐富高爾基體、微絲水腫，細胞結構正常，細胞核輕度邊集（見圖1.1G）。

從以上電鏡觀察結果可以看出，不同時間點的模型組關節軟骨細胞比較空白組軟骨細胞出現明顯水腫，內質網出現溶解、線粒體固縮、有細胞結構破裂，細胞固縮的情況，經過一段時間的干預后，早期干預組比較模型組關節軟骨無明顯改善，中期干預組比較模型組有關節軟骨有不同程度的改善，晚期干預組較治療模型組關節軟骨有明顯改善。

2.2 掃描電鏡 通過掃描電鏡觀察關節軟骨的形態變化，可以看到，空白組關節軟骨表面光滑，關節軟骨結果完整，關節腔表面未見滲出物附著（見圖1.2A）。早期模組關節軟骨表面不光滑，軟骨出現變性，關節腔表面有少量量滲出物附著（見圖1.2B）。早期干預組關節軟骨表面不光滑，軟骨出現變性，關節腔表面有少量滲出物附著（見圖1.2C）。中期模型組軟骨表面不光滑，軟骨出現變性，關節腔表面有大量滲出物附著（見圖1.2D）。中期干預組軟骨表面部分結構光滑，軟骨未出現變性，關節腔表面有少量滲出物附著（見圖1.2E）。晚期模型組關節軟骨表面有結晶物質附著，表面結構異常、變形、破損，不光滑，關節腔表面有大量滲出物附著，紅細胞出現，出現出血的情況（見圖1.2F）。晚期干預組關節軟骨表面結構光滑，關節腔表面有少量滲出物附著，未見紅細胞出現以及出血的情況（見圖1.2G）。從以上掃描電鏡觀察結果可以看出不同模型組關節軟骨比較正常組軟骨出現壞死、變性、有大量大量滲出物附著的情況，經過一段時間的干預后看出，早期干預組比較模型組關節軟骨無改善，中期干預組較模型組關節軟骨有不同程度的改善，晚期干預組較模型組比較關節軟骨有顯著的改善。

3 討論

現代研究證實，推拿手法有助于改善關節周圍的血液循環和骨內微循環，降低異常的血液黏度，降低骨內壓，可促進滑液向關節軟骨的浸透和擴散，改善關節軟骨的營養和關節的潤滑，并能減輕軟骨的退變，還可增加股四頭肌之肌力，改善關節的活動度[2-3]。Salter[4]經過長期的研究證實：早期持續被動運動可促進軟骨的再生和修復，認為關節的反復屈伸運動可刺激軟骨組織中未分化的間質細胞向軟骨細胞轉化，加快軟骨組織的修復。

拔伸松動法是以中醫推拿筋骨并重的理論為基礎，在臨床工作中總結創新形成的系列手法，包括對膝關節相關附屬肌肉的松解，以及股脛關節、髕股關節的被動運動，體現了筋骨同治、動靜結合的治療原則。前期的臨床研究證實，采用膝關節拔伸松動法治療早中期 KOA 患者療效確切，可有效減輕疼痛，明顯改善關節活動度[5]。前期開展的基礎研究證實拔伸松動法可降低 KOA 兔膝關節液中白介素-1β（IL-1β）和腫瘤壞死因子α（TNF-α）的水平[6-7]。

關節軟骨退變是OA病理改變的主要特征，軟骨細胞破壞凋亡是OA發病機制的重要環節[8]。本實驗中模型組透射電鏡觀察見，兔膝關節軟骨細胞呈現細胞水腫，內質網溶解、線粒體固縮、細胞結構破裂、細胞固縮等病理改變，掃描電鏡觀察見，兔膝關節軟骨出現不同程度的軟骨表面不光滑、變性、破損，關節腔表面滲出物附著物等改變，且上述改變呈現早期<中期<晚期，與預期表現相一致。經拔伸松動法干預后，晚期干預組透射電鏡及掃描電鏡觀察顯示關節軟骨有明顯改善，中期干預組透射電鏡及掃描電鏡觀察顯示關節軟骨有不同程度的改善，說明拔伸松動手法具有延緩膝中期、晚期KOA模型兔關節軟骨損傷，對損傷的關節軟骨細胞具有修復的作用。早期模型兔軟骨掃描電鏡及投透射電鏡觀察顯示損傷程度輕，但早期治療組超微結構改變不明顯，這一結果與預期不符，是干預方式的局限性還是造模方法存在問題，尚待進一步的研究證據。

參考文獻：

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[4]Salter RB.History of restand motion and the scientific basic for early continuou spassive motion[J].Hand Clincs，1996，12（1）：1-11.

[5]王春林，趙永康，趙志勇，等.拔伸松動法治療膝關節骨性關節炎的臨床觀察[J].按摩與康復醫學，2011，5（2）：23-25.

[6]王春林，向勇，田啟東，等.拔伸松動法治療兔膝骨性關節炎的實驗研究[J].云南中醫中藥雜志，2010，31（9）：14-16.

[7]王春林，向勇，田啟東，等.“拔伸松動法”對膝骨性關節炎兔白細胞介素1β 和腫瘤壞死因子α 的影響[J].環球中醫藥雜志，2014.7（2）：85-88.

[8]Goldring SR，Goldring MB.The role of cytokines in cartilage matrix degeneration in osteoarthritis[J].Clinical Orthopaedics And Related Reserch，2004（427）：27-36.

（收稿日期：2021-11-09）