苦膽草片含量測定的方法學驗證

王玲芬 鄭梅

摘要：目的 對苦膽草片中龍膽苦苷的含量測定方法進行驗證。方法 反相高效液相色譜法。色譜柱為Agilent TC-C18（150 mm×4.6 mm，5 um）柱，流動相為甲醇-水（25：75）;柱溫為30℃;檢測波長為270 nm，流速為0.8 mL/min。結果 龍膽苦苷在0.0508 mg/mL～0.3556mg/mL范圍內有良好的線性關系，r=0.999909，平均加樣回收率為101.2%，RSD=1.2%（n=9）。結論 該法分離效果好，結果準確、可靠，苦膽草片含量測定的方法可行。

關鍵詞：苦膽草片;龍膽苦苷;含量測定;高效液相色譜法

中圖分類號：R927.2 文獻標志碼：A 文章編號：1007-2349（2018）07-0074-03

苦膽草片在原標準糖衣片（《中華人民共和國衛生部藥品標準》中藥成方制劑第八冊（WS3-B-1555-93）[1]的基礎上增加薄膜衣片，薄膜衣片具有生產周期短（3～4 h）、用料少、衣片增重小（小于3%）、衣層機械強度及抗濕、熱性好，對藥物的崩解影響小以及制劑色澤穩定、美觀等優點。現上市的劑型苦膽草片（糖衣片）（WS3-B-1555-93），無含量測定項，筆者認為不足以控制本品的質量，由于本品中僅由堅龍膽一味藥材制成，通過參照《中國藥典》2010年版一部[2]龍膽藥材項中堅龍膽的[含量測定]項和《中國藥典》2010版第一部（附錄ⅩⅧA）中藥質量標準分析方法驗證指導原則，對苦膽草片的含量測定方法進行驗證。

1 儀器、試藥和試劑

1.1 儀器 高效液相色譜儀：型號：島津LC-2010AHT SHIMADZU（包括輸液泵、自動進樣器、UV-Vis檢測器、CLASS-VP色譜工作站）;電子天平：型號：BP211D Sartorius。

1.2 試藥和試劑 樣品預處理：所用試劑均為分析純，高效液相分析所用甲醇為色譜純，水為娃哈哈純凈水;對照品：龍膽苦苷 中國藥品生物制品檢定所 編號：110770-200712;樣品：云南滇中藥業有限公司生產的苦膽草片批號：20100101、20100102、20100103。

2 實驗方法

2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent TC-C18 5um色譜柱（4.6×150 mm）;流動相：甲醇-水（25：75）;柱溫：30℃;檢測波長：270 nm;流速：0.8 mL/min;進樣量：10 uL;理論塔板數按龍膽苦苷峰計算應不低于3000。

2.2 對照品貯備溶液的制備 精密稱取在五氧化二磷干燥器中干燥12 h龍膽苦苷對照品適量，加甲醇制成每1 mL含0.2 mg的溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備 取本品20片，除去薄膜衣，精密稱定，研細，取0.3 g，精密稱定，精密加入甲醇20 mL，稱定重量，加熱回流15 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，濾液備用，精密量取續濾液2 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

3 方法學考察

3.1 線性關系考察 精密吸取對照品貯備溶液1 mL，2 mL，3 mL，4 mL，5 mL、6 mL、7 mL置10 mL容量瓶中，分別加甲醇稀釋至刻度，配制成系列濃度的對照品溶液：A：龍膽苦苷0.0508 mg/mL;B：龍膽苦苷0.1016 mg/mL;C：龍膽苦苷0.1524 mg/mL;D：龍膽苦苷0.2032 mg/mL;E：龍膽苦苷0.2540 mg/mL;F：龍膽苦苷0.3048 mg/mL;G：龍膽苦苷0.3556 mg/mL;

在上述“色譜條件”下，測定峰面積，以對照品濃度作橫坐標（X），峰面積作為縱坐標（Y）：線性回歸方程Y= 4.9906e-008X-0.00094586，r=0.999909（n=7）;表明龍膽苦苷在0.0508mg/mL～0.3556mg/mL范圍內具有良好的線性關系。（見表1）

表1 線性關系考察表

3.2 專屬性試驗 按處方比例，取去除堅龍膽藥材，按生產工藝制備得陰性樣品，并依“供試品溶液的制備”項下，同法處理后，制得陰性空白對照液，按前述色譜條件，分別對空白對照液，供試品溶液，對照品溶液各進樣10 uL，測定。結果在空白對照色譜中，龍膽苦苷峰處無其它藥物干擾。

3.3 重復性試驗 稱取批號為20100101的樣品6份，照“供試品溶液的制備”項下方法進行處理。分別測定，龍膽苦苷的含量。結果龍膽苦苷平均含量為4.90 mg/片，RSD=1.7%（n=6），重復性良好。見表2。

表2 重復性試驗結果

3.4 中間精密度 取批號為20100101的樣品，分別由不同檢驗人員處理樣品測定含量，結果見表3。

表3 中間精密度的考察結果

3.5 準確度試驗 取重復性項下批號為20100101的樣品6份各約0.15 g，分別精密加入龍膽苦苷對照品貯備溶液（含龍膽苦苷1.986mg/mL），照“供試品溶液的制備”項下的方法進行處理，按上述“色譜條件”進樣，進行測定，測得平均回收率為 101.2%，RSD=1.2%（n=9）。見表4。

表4 加樣回收率試驗結果

3.6 穩定性試驗 取本品20片，除去薄膜衣，精密稱定，研細，取0.4 g，精密稱定，精密加入甲醇20 mL，稱定重量，加熱回流15 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，濾液備用，精密量取續濾液2 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。按含量測定方法測定8次，間隔時間為0、2、4、6、8、10、12、24 h，平均含量為4.89 mg/片，RSD=0.8 %（n=8），表明供試品溶液在24 h內穩定。見表5。

表5 穩定性試驗結果

3.7 含量限度 取本品約0.1 g，0.2 g，0.3 g，0.4 g，0.5 g各2份，精密稱定，置50 mL量瓶中，加甲醇適量，超聲處理（功率120 W，頻率40 KHz）40 min，取出，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，棄去初濾液，取續濾液，即得，按含量測定方法分別測定，結果見表6。

表6 樣品含量測定的結果

《中國藥典》2010年版一部堅龍膽項下[含量測定]規定：堅龍膽按干燥品計算，含龍膽苦苷不得少于1.5%，以苦膽草片處方中堅龍膽處方量以完全不損失計，制成的成品中每片含龍膽苦苷的量為6.0mg，考慮到龍膽苦苷具有一定的揮發性及在制法過程之中的損失，且藥材的產地、采收、加工等因素。將苦膽草片中每片含龍膽苦苷的含量以70%計，總量確定為不得少于2.0mg（即每片含堅龍膽以龍膽苦苷計，不得少于2.0mg）。

4 結論

結果表明苦膽草片[含量測定]項的方法，分離效果好，結果準確可靠，此方法是可行的。

堅龍膽為苦膽草片中的主藥，其主要成分為龍膽苦苷，本實驗有機溶劑進行提取，使所要測定的龍膽苦苷很好的分離。

堅龍膽來源于龍膽科植物滇龍膽Gentiana rigescens Franch 的干燥根和根莖。

含量測定法有內標法、外標法。自身對照法，面積歸一化法，實驗選用的是外標法，測定出對照品和供試品的峰面積，再對供試品的含量進行計算。

苦膽草片中只有堅龍膽一味藥，生產工藝采用一半藥材粉碎和一半提制膏，在生產過程的每一步驟，龍膽苦苷下降，故將苦膽草片中每片含龍膽苦苷的含量以70%計，總量確定為不得少于2.0mg。

參考文獻：

[1]中華人民共和國衛生部藥典委員會. 《中華人民共和國衛生部藥品標準》.中藥成方制劑[S].1998.

[3]中華人民共和國藥典委員會.中華人民共和國藥典2010年版（一部）[M].北京：中國醫藥科技出版社，2010.

（收稿日期：2018-03-09）