豬肺炎支原體DJ-166 株高密度發(fā)酵工藝優(yōu)化

陳麗萍 兆豐華生物科技（福州）有限公司 福州 350014

豬支原體肺炎 （Mycoplasmal pneumonia of swine，MPS），又稱豬喘氣病、豬地方性流行性肺炎，是由豬肺炎支原體 （Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp）引起的以傳染性高、發(fā)病率高和病死率低為主要特征的慢性呼吸道傳染病，患豬常表現(xiàn)為咳嗽、喘氣、呼吸困難等癥狀，是造成我國目前養(yǎng)豬業(yè)嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失的傳染病之一[1-2]。 豬支原體肺炎是一種慢性頑固性疾病， 抗支原體藥可以抑制該病， 但難以根除，且停藥后易復(fù)發(fā)產(chǎn)生耐藥，故防控該病最好的方法是接種疫苗[3]。 目前國內(nèi)弱毒活疫苗免疫原性較好，使用效果好，但主要通過胸腔注射、肺內(nèi)注射或鼻腔接種，操作麻煩，推廣受限，而進(jìn)口滅活苗售價高[1,4]。 近年來，國產(chǎn)滅活疫苗研發(fā)速度加快，本文對豬肺炎支原體高密度發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化， 為豬支原體肺炎滅活疫苗的制備提供參考依據(jù)。

1 材 料

豬肺炎支原體DJ-166 株： 由北京大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司研發(fā)中心提供；豬血清（經(jīng)56 ℃、30 min 熱滅活)、MEM 購自 Gibco 公司；PPLO 粉、水解乳蛋白購自BD 公司；酵母粉、腦心浸粉購自O(shè)xoid 公司；NaCl、KCl、CaCl2、Na2HPO4·12H2O、KH2PO4、MgCl2·6H2O、酚紅等均購自國藥。

2 方 法

將豬肺炎支原體DJ-166 株凍干菌種按8%～10%比例接種到CH 液體培養(yǎng)基中，混勻，置37 ℃培養(yǎng)，觀察顏色變化，pH 降至6.8 時收獲菌液，經(jīng)檢驗合格后作為一級種子。 以相同的方法進(jìn)行二級種子繁殖， 經(jīng)檢驗合格后作為二級種子。 以下除在2.1 項試驗中有使用原始配方CH 液體培養(yǎng)基培養(yǎng)的種子， 其余均使用優(yōu)化的CH 液體培養(yǎng)基培養(yǎng)的種子。

2.1 不同培養(yǎng)基對Mhp 繁殖的影響試驗 分別在2 個50 L 發(fā)酵罐中加入含15%豬血清的原始配方CH 液體培養(yǎng)基、優(yōu)化CH 液體培養(yǎng)基30 L，初始pH調(diào)為7.8， 取二級種子按8%接種量接種，37 ℃、50～150 r/min 培養(yǎng)， 當(dāng) pH 下降到 7.0、6.9、6.8、6.7、6.6時分別取樣，測定CCU（顏色改變單位）。

2.2 培養(yǎng)基不同血清添加量比較試驗 分別在3 個50 L 發(fā)酵罐中加入含10%、15%、20%豬血清的優(yōu)化CH 液體培養(yǎng)基30 L，初始 pH 調(diào)為 7.8，取二級種子按 8%接種量接種，37 ℃、50～150 r/min 培養(yǎng)，當(dāng) pH 下降到 7.0、6.9、6.8、6.7、6.6 時分別取樣，測定CCU。

2.3 培養(yǎng)基不同初始pH 比較試驗 在3 個50 L發(fā)酵罐中加入含15%豬血清的優(yōu)化CH 液體培養(yǎng)基30 L，初始 pH 分別調(diào)為 7.6、7.8、8.0，取二級種子按8%接種量接種，37 ℃、50～150 r/min 培養(yǎng)， 待 pH 降至 7.0、6.9、6.8、6.7、6.6 時分別取樣，測定 CCU。

2.4 不同接種量比較試驗 在3 個50 L 發(fā)酵罐中加入含15%豬血清的優(yōu)化CH 液體培養(yǎng)基30 L，初始pH 調(diào)為7.8， 取二級種子分別按5%、8%、10%接種量接種，37 ℃、50～150 r/min 培養(yǎng)， 待 pH 降至7.0、6.9、6.8、6.7、6.6 時分別取樣，測定 CCU。

2.5 大發(fā)酵罐培養(yǎng) 在1 000 L 發(fā)酵罐中加入300 L 含15%豬血清的優(yōu)化CH 液體培養(yǎng)基， 初始pH 調(diào)為7.8， 取二級種子按5%接種量接種，37 ℃、50～150 r/min 培養(yǎng)， 待 pH 降至 7.0、6.9、6.8、6.7、6.6時分別取樣，測定CCU。

2.6 菌液濃度測定方法 采用顏色改變單位（CCU）計數(shù)法[1]。 取 14 支無菌小試管，第 1～10 管每管加入1.8 mL 液體培養(yǎng)基 ， 第11～14 管每管加入1.6 mL 培養(yǎng)基； 在第 1 管加入 0.2 mL 待測菌液，混勻后，從中吸出0.2 mL 加入到第2 管，再混勻后取出0.2 mL 加入第3 管，以此類推，直到第10 管；從第8、9、10 管分別取出稀釋好的菌液0.4 mL 加入到第 11、12、13 管 1.6 mL 培養(yǎng)基中； 第 14 管不加菌液作為對照。 37 ℃靜置15 d，觀察顏色變化，計算CCU 值。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同培養(yǎng)基對Mhp 繁殖的影響 Mhp 對培養(yǎng)基的營養(yǎng)水平要求較高，自身合成能力也有限，需要添加多種復(fù)雜的營養(yǎng)物質(zhì)[5]。 從培養(yǎng)時間上看，用優(yōu)化的CH 液體培養(yǎng)基培養(yǎng)， 培養(yǎng)時間比用原始配方CH 液體培養(yǎng)基快 24～72 h。 由表 1 可知，用優(yōu)化的CH 液體培養(yǎng)基培養(yǎng)， 菌液培養(yǎng)滴度最高能達(dá)到5×109CCU/mL，而用原始配方CH 液體培養(yǎng)基，菌液培養(yǎng)滴度最高只能達(dá)到1×108CCU/mL。

表1 不同培養(yǎng)基對Mhp 發(fā)酵的影響

3.2 培養(yǎng)基血清添加量的確定 血清的添加量是培養(yǎng)基營養(yǎng)水平的重要體現(xiàn)，對Mhp 發(fā)酵過程起重要作用。由表2 可見，在CH 液體培養(yǎng)基中添加10%血清時， 菌液培養(yǎng)滴度最高只能達(dá)到108CCU/mL；血清添加量為20%時， 培養(yǎng)液 pH 降到7.0、6.9 時，菌液培養(yǎng)滴度比添加15%血清時高，但是考慮到血清成本比較高， 且最高菌液培養(yǎng)滴度均為5×109CCU/mL，故生產(chǎn)時選用血清添加量為15%較為適宜。

表2 培養(yǎng)基血清含量對Mhp 發(fā)酵的影響

3.3 培養(yǎng)基初始pH 的確定 培養(yǎng)基初始pH 對Mhp 發(fā)酵起重要作用。 從培養(yǎng)時間看，培養(yǎng)基初始pH 為 7.6 時， 培養(yǎng)時間最短， 培養(yǎng)基初始 pH 為8.0 時， 培養(yǎng)時間最長。 由表 3 可見， 培養(yǎng)基初始pH 為 8.0 時， 菌液培養(yǎng)滴度最高只能達(dá)到 5×108CCU/mL，培養(yǎng)基初始 pH 為 7.6、7.8 時，菌液培養(yǎng)滴度最高分別能達(dá)到 1×109、5×109CCU/mL。 由此可見，培養(yǎng)基初始pH7.8 最為適合。

表3 培養(yǎng)基初始pH 對Mhp 發(fā)酵的影響

3.4 接種量的確定 從培養(yǎng)時間上看， 接種量為10%、8%、5%， 培養(yǎng)時間隨著接種量的減少而增加；由表4 可知，接種量為10%、8%時，菌液培養(yǎng)滴度最高都能達(dá)到5×109CCU/mL，而接種量為5%時，菌液培養(yǎng)滴度最高能達(dá)到1×1010CCU/mL。 接種密度并不是越高越好， 接種密度較高會使支原體在繁殖早期消耗較多的營養(yǎng)物質(zhì)， 使得支原體繁殖提早進(jìn)入衰亡期[6]，所以，在Mhp DJ-166 株發(fā)酵過程中，接種量以5%較為適宜。

表4 接種量對Mhp 繁殖的影響

3.5 大發(fā)酵罐培養(yǎng)收獲點的確定 根據(jù)以上試驗結(jié)果， 在1 000 L 發(fā)酵罐中加入300 L 含15%豬血清的CH 液體培養(yǎng)基，初始pH 調(diào)為7.8，按5%接種量接種進(jìn)行兩批次試驗。 由表5 可知，培養(yǎng)基pH 達(dá)到6.7 ～6.8 時， 菌液培 養(yǎng)滴度 最高 能 達(dá)到 1×1010CCU/mL，兩批次菌液培養(yǎng)滴度相差不多。 因每次培養(yǎng)的培養(yǎng)量、營養(yǎng)水平、初始pH、接種量等并不一定相同，導(dǎo)致培養(yǎng)時間長短不一，為了避免培養(yǎng)過頭或過早收獲，經(jīng)過多次試驗驗證，培養(yǎng)時通過pH變化情況來確定收獲點， 菌液培養(yǎng)滴度批間差異較小。

4 討 論

Mhp 對繁殖條件要求苛刻，需添加多種營養(yǎng)物質(zhì)，而高密度發(fā)酵培養(yǎng)Mhp 對營養(yǎng)水平要求更加嚴(yán)苛，本試驗通過對PPLO 粉、酵母粉、腦心浸粉、MEM等的添加比例進(jìn)行優(yōu)化， 使培養(yǎng)基在發(fā)酵培養(yǎng)中得到充分利用， 使培養(yǎng)周期縮短， 培養(yǎng)滴度從1×108CCU/mL 大幅度提高到 5×109CCU/mL。

Mhp 繁殖需要血清提供各種微量元素、 生長因子、維生素等，血清的廠家、添加比例對Mhp 繁殖影響很大。 鄭鐵鑫等[7]和李天增等[8]對不同廠家血清進(jìn)行對比試驗，結(jié)果表明不同廠家血清對Mhp 繁殖影響較大，培養(yǎng)滴度相差可達(dá)100 倍。 劉鵬等[9]用添加不同量豬血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)Mhp HN0613 株， 表明添加15%血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)最適宜，與本研究的結(jié)果一致。

王志國[10]通過改進(jìn)Mhp 培養(yǎng)工藝，可縮短培養(yǎng)時間，培養(yǎng)滴度提高至109CCU/mL 以上。 培養(yǎng)基初始pH、接種密度、收獲時的pH 等都是影響Mhp 繁殖的重要因素，朱秀同等[5]和劉鵬等[9]用發(fā)酵罐高密度發(fā)酵培養(yǎng)Mhp，通過對培養(yǎng)基初始pH、接種密度、通氣量、攪拌速度、收獲時間等進(jìn)行優(yōu)化，培養(yǎng)滴度分別達(dá)到 1×109CCU/mL、1×1010CCU/mL。 本研究用含15%豬血清的CH 液體培養(yǎng)基（初始pH 為7.8），按5%接種量接種，在培養(yǎng)基pH 達(dá)到6.7～6.8 時，菌液培養(yǎng)滴度最高能達(dá)到1×1010CCU/mL， 達(dá)到國內(nèi)領(lǐng)先水平。本研究可為高密度發(fā)酵培養(yǎng)Mhp 提供參考，需注意的是，培養(yǎng)基初始pH、接種密度、收獲時的pH 等與Mhp 菌株、活力、滴度、培養(yǎng)量等密切相關(guān)，應(yīng)根據(jù)每個菌株情況、發(fā)酵工藝而進(jìn)行優(yōu)化。