一株較強(qiáng)致病性雞大腸桿菌的分離與防控

喬欣君 廈門(mén)惠盈動(dòng)物科技有限公司 福建廈門(mén) 361023

家禽養(yǎng)殖過(guò)程中，細(xì)菌性疾病尤為常見(jiàn)，且傳染快、發(fā)病率與病死率較高[1]。 某養(yǎng)雞場(chǎng)雞群突發(fā)疾病，其癥狀為體溫升高，精神不振，食欲降低或停食，排灰白色稀便，且傳染快、發(fā)病急、病死率高。通過(guò)解剖分別從肺、肝、脾臟3 種器官分離純化得到活菌數(shù)較高的一株病原菌， 最終確定為大腸桿菌（Escherichia coli）。

國(guó)內(nèi)外關(guān)于雞大腸桿菌病防治的報(bào)道較多[2-5]，其中多數(shù)以抗生素類藥物作為治療首選方案， 而抗生素的大量使用會(huì)引起多種負(fù)面影響， 例如提高細(xì)菌的耐藥性、動(dòng)物機(jī)體免疫下降、藥物殘留及其生態(tài)環(huán)境破壞等[6]。 當(dāng)有藥物殘留的畜禽肉類產(chǎn)品進(jìn)入人體并在人體富集，則會(huì)對(duì)人體健康產(chǎn)生危害[7-8]。農(nóng)業(yè)農(nóng)村部第194 號(hào)公告要求2020 年7 月起飼料端禁抗、養(yǎng)殖端限抗減抗，而益生菌作為有活性的微生物，具有抗菌活性卻無(wú)抗生素所帶來(lái)的種種弊端，它不僅能改善動(dòng)物腸道健康， 還能促進(jìn)食物在動(dòng)物消化道內(nèi)消化，提高飼料利用率，是抗生素的替代品之一[9]。

本研究從病死雞的肺、肝、脾臟3 種器官分離出大腸桿菌，通過(guò)鏈霉素、新霉素、慶大霉素等9 種抗生素進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，并利用枯草芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、 植物乳桿菌等9 株益生菌進(jìn)行大腸桿菌抑制試驗(yàn)。通過(guò)藥敏試驗(yàn)及益生菌抑菌試驗(yàn)，從而確定最佳的治療方案， 為雞細(xì)菌性疾病的防治提供一條綠色環(huán)保的道路， 也為益生菌產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病樣 由某雞養(yǎng)殖場(chǎng)提供病死雞若干羽，且死亡不超過(guò)12 h。

1.1.2 供試藥物 鏈霉素、新霉素、慶大霉素、卡那霉素、四環(huán)素、阿莫西林、氧氟沙星、利福平、氨芐西林9 種抗生素藥敏紙片， 購(gòu)自杭州濱和微生物試劑有限公司。

1.1.3 供試益生菌 枯草芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、植物乳桿菌、干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌、釀酒酵母、產(chǎn)朊假絲酵母，均為本單位實(shí)驗(yàn)室分離保存。

1.2 病原菌分離與鑒定 隨機(jī)選取3 羽病死雞，解剖后取出肺、肝、脾臟，用灼熱的刀片燙死表面雜菌，再通過(guò)無(wú)菌操作分別將組織剪碎， 采用無(wú)菌生理鹽水稀釋100 倍混勻后，吸取0.1 mL 涂布營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板，肺、肝、脾臟各1 個(gè)平板，總共9 個(gè)平板，倒置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，長(zhǎng)出單菌落后再劃線純化培養(yǎng)。

純化后的菌株采用16S rRNA 細(xì)菌通用引物[10]進(jìn)行擴(kuò)增， 正向引物為27F：5'-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'， 反向引物為 1492R：5'-TACGGCTACCTTGTTACGAC-3'， 由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司完成。 所得序列經(jīng)過(guò)NCBI（美國(guó)生物技術(shù)信息中心） 數(shù)據(jù)庫(kù)的BLAST 進(jìn)行在線同源性比對(duì)，再參考《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[11]與《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[12]方法進(jìn)行菌株生理生化試驗(yàn)及鑒定，試驗(yàn)項(xiàng)目包括：革蘭氏染色特性、芽孢有無(wú)、糖發(fā)酵試驗(yàn)、V-P 試驗(yàn)、吲哚反應(yīng)、硝酸鹽還原、淀粉水解、明膠液化等。

1.3 藥物敏感性試驗(yàn) 采用藥敏紙片瓊脂擴(kuò)散法[13]。吸取 1 mL 活菌數(shù)約為 108CFU/mL 的菌液，加入15 mL 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中（50 ℃），混合均勻后傾注倒入滅菌培養(yǎng)皿中，冷卻凝固后貼上藥敏紙片，靜置20 min 后， 將平皿置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)24 h，并用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑。

1.4 益生菌抑菌試驗(yàn) 采用管碟法[14-15]。取1 mL 菌懸液加入50 ℃ 100 mL 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中， 搖勻（含菌終濃度為105CFU/mL），倒入培養(yǎng)皿中（厚度約為3 mm），待冷卻凝固后將牛津杯置于平板中，往牛津杯中加入 0.25 mL 益生菌培養(yǎng)液 （濃度為108CFU/mL），置于37 ℃下培養(yǎng)24 h。觀察有無(wú)抑菌圈產(chǎn)生，并用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑。

1.5 動(dòng)物模擬試驗(yàn) 隨機(jī)選取60 只健康小鼠，分成3 組、每組20 只，分別為對(duì)照組、大腸桿菌感染組、益生菌保護(hù)組。 3 組小鼠同等條件飼養(yǎng)3 d 后，感染組皮下注射分離菌1 mL（濃度為106CFU/mL）；益生菌保護(hù)組皮下注射分離菌1 mL （濃度為106CFU/mL），同時(shí)飲水中加入復(fù)合乳酸菌發(fā)酵培養(yǎng)物； 對(duì)照組注射1 mL 滅菌生理鹽水。 各組隔離飼養(yǎng)，自由飲水，連續(xù)觀察7 d。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌分離與鑒定 病死雞肺、肝、脾臟經(jīng)剪碎、稀釋100 倍后涂布培養(yǎng)，分離得到圓形、邊緣整齊、表面光滑、半透明、小凸起的菌落，且該菌株在3 個(gè)器官中均有分布，活菌數(shù)較高。 純化后的菌株采用 16S rRNA 擴(kuò)增測(cè)序， 獲得的片段長(zhǎng)度為1 417 bp，擴(kuò)增測(cè)序結(jié)果見(jiàn)圖1。 該菌株基因序列通過(guò)BLAST 軟件進(jìn)行同源性比對(duì)，結(jié)果與Escherichia coli SCU-308 的同源性為99.93%。

圖1 菌株基因擴(kuò)增測(cè)序結(jié)果

該菌株的生理生化試驗(yàn)結(jié)果為： 革蘭氏染色陰性、無(wú)芽孢，MR 試驗(yàn)、吲哚反應(yīng)、糖發(fā)酵試驗(yàn)等為陽(yáng)性，V-P 試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)為陰性，結(jié)果見(jiàn)表1。 結(jié)合16S rRNA 擴(kuò)增測(cè)序結(jié)果，通過(guò)查閱《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》與《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》，可以確定該菌株為大腸桿菌。

表1 菌株生理生化特性

2.2 藥物敏感性試驗(yàn) 從病死雞中篩選獲得的大腸桿菌，用鏈霉素、新霉素、慶大霉素等9 種抗生素進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，以確定該菌株的耐藥性。該大腸桿菌分離株對(duì)鏈霉素表現(xiàn)敏感， 對(duì)卡那霉素表現(xiàn)中度敏感，對(duì)新霉素、慶大霉素、四環(huán)素等其它7 種常見(jiàn)抗生素表現(xiàn)不敏感（見(jiàn)表2）。 該結(jié)果與于鵬杰[16]、程漢等[17]及郭延敏[18]的研究結(jié)果存在差異，說(shuō)明不同來(lái)源分離的大腸桿菌，其耐藥性差異較大，且表明抗生素的長(zhǎng)期使用提高了大腸桿菌的耐藥性[19-21]。

表2 大腸桿菌對(duì)9 種藥敏紙片的敏感性

2.3 益生菌抑菌試驗(yàn) 用本單位實(shí)驗(yàn)室的9 株益生菌對(duì)大腸桿菌進(jìn)行抑制試驗(yàn)。由表3 結(jié)果可知，大腸桿菌對(duì)植物乳桿菌、干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌等乳酸菌表現(xiàn)極敏感，對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌、戊糖片球菌、乳酸片球菌表現(xiàn)高敏感， 對(duì)枯草芽孢桿菌表現(xiàn)低敏感，對(duì)酵母菌不敏感。 有研究表明[22-24]乳酸菌通過(guò)產(chǎn)生抗菌物質(zhì)，從而達(dá)到抑制有害細(xì)菌的生長(zhǎng)，其中植物乳桿菌、 干酪乳桿菌與鼠李糖乳桿菌是產(chǎn)生抗菌肽來(lái)達(dá)到抑制病原菌的作用[25-28]。

表3 9 種益生菌對(duì)大腸桿菌的抑制效果

2.4 動(dòng)物模擬試驗(yàn) 將分離得到的大腸桿菌及植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、干酪乳桿菌等乳酸菌復(fù)合發(fā)酵培養(yǎng)的發(fā)酵液進(jìn)行動(dòng)物（小鼠）試驗(yàn)。試驗(yàn)表明，未作任何處理的對(duì)照組7 d 內(nèi)無(wú)小鼠死亡； 大腸桿菌感染組小鼠在3 d 內(nèi)死亡率達(dá)90%； 益生菌保護(hù)組小鼠在注射分離菌后第1 d 死亡2 只， 死亡率為10%，與大腸桿菌組差異顯著（P＜0.05），見(jiàn)表 4。剖檢死亡小鼠， 可見(jiàn)肝臟水腫、 脾臟及肺點(diǎn)狀出血等癥狀，取小鼠的肺、肝、脾臟劃線接種營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，長(zhǎng)出菌落；劃線純化，經(jīng)過(guò)16S rRNA 擴(kuò)增測(cè)序，表明該菌與試驗(yàn)注射的大腸桿菌為同種細(xì)菌， 說(shuō)明該大腸桿菌對(duì)小鼠有較強(qiáng)的致病能力。 而解剖存活的益生菌保護(hù)組小鼠，未見(jiàn)剖檢病變，說(shuō)明復(fù)合乳酸菌發(fā)酵液能有效抑制大腸桿菌。

表4 動(dòng)物模擬試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié) 論

從病死雞的肺、肝、脾臟中分離出一株具有較強(qiáng)致病性的大腸桿菌，該菌對(duì)新霉素、慶大霉素、四環(huán)素等7 種常見(jiàn)抗生素具有耐受性，而對(duì)植物乳桿菌、干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌等乳酸菌敏感。通過(guò)動(dòng)物試驗(yàn)表明， 本次試驗(yàn)所用的復(fù)合乳酸菌發(fā)酵液能有效抑制大腸桿菌， 從而降低或預(yù)防由大腸桿菌引起的細(xì)菌性疾病的發(fā)生。 建議在實(shí)際養(yǎng)殖過(guò)程中，若發(fā)生細(xì)菌性疾病，應(yīng)先做藥敏試驗(yàn)，對(duì)癥用藥，避免抗生素的濫用。 或在日常養(yǎng)殖過(guò)程中使用益生菌產(chǎn)品，以減少或預(yù)防細(xì)菌性疾病的發(fā)生，從而減少或替代抗生素的使用。 根據(jù)本次試驗(yàn)所用復(fù)合乳酸菌抑制大腸桿菌的研究結(jié)果， 后續(xù)將進(jìn)一步檢測(cè)乳酸菌對(duì)其它種類致病菌的抑制效果，同時(shí)優(yōu)化菌株復(fù)配、發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵培養(yǎng)條件等相關(guān)技術(shù)問(wèn)題， 為益生菌產(chǎn)品開(kāi)發(fā)奠定良好的基礎(chǔ)。