2-氨基苯并咪唑衍生物的合成及抑菌活性初步研究

馮宇喆，代文哲，劉根炎，巨修練

(武漢工程大學(xué) 化工與制藥學(xué)院，湖北武漢 430205)

農(nóng)藥是保障糧食豐產(chǎn)的有效手段之一，開發(fā)更加安全、高效、經(jīng)濟(jì)和使用方便的產(chǎn)品成為當(dāng)今農(nóng)藥發(fā)展的主要方向。隨著全球人口數(shù)量的不斷增加，對糧食及果蔬的需求也隨之增長，加之地球變暖，導(dǎo)致各種病原菌的危害愈來愈突出，因此，對殺菌劑的需求也不斷增加。苯并咪唑類化合物由于其自身的優(yōu)良特性，在材料、生物、醫(yī)藥、農(nóng)藥等領(lǐng)域均有廣泛應(yīng)用[1-3]。該類化合物在殺菌劑中占有重要地位，主要品種有多菌靈、丙硫多菌靈、苯菌靈、噻菌靈、麥穗寧等，具有廣泛的殺菌活性，在防治農(nóng)作物、水果、蔬菜、棉花等的病害防治方面發(fā)揮著重要作用[4-6]。

灰霉病病原菌(Botrytis cinerea)寄主范圍廣，具有繁殖速度快、產(chǎn)孢量大、遺傳變異大和適合度高等特點(diǎn)，可以引起番茄、黃瓜、草莓等蔬果及花卉發(fā)生灰霉病，極大地影響了蔬菜瓜果的產(chǎn)量[7-9]。近年來，灰霉病以化學(xué)防治為主，目前普遍使用的藥劑品種有多菌靈、苯菌靈、速克靈等。由于部分殺菌劑的廣泛長期單一使用，導(dǎo)致病原菌對這些藥劑產(chǎn)生了抗性，防治效果降低了，農(nóng)用成本增加了[10-12]，因此，開發(fā)新型對灰霉病病原菌具有較好防治效果的殺菌劑具有重要意義。

在總結(jié)文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，本研究采用了多菌靈和苯菌靈的公共骨架結(jié)構(gòu)(2-氨基苯并咪唑)作為所設(shè)計化合物的骨架，在參考了敵菌靈結(jié)構(gòu)中芳環(huán)取代的特點(diǎn)后，利用活性基團(tuán)拼合等原理，設(shè)計并合成了2-N-取代芐基苯并咪唑類化合物(圖1)。合成路線以2-氨基苯并咪唑為起始原料，與不同取代的芳醛反應(yīng)生成中間體N-(1H-苯并[d]咪唑-2-基)-1-取代苯基甲亞胺，然后還原得到目標(biāo)產(chǎn)物[13-17]。并初步測定了12個目標(biāo)產(chǎn)物對灰霉病病原菌的抑制活性。

圖1 目標(biāo)化合物的設(shè)計

圖2 目標(biāo)化合物的合成路線

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

RY-1型熔點(diǎn)儀(溫度計未校正，天津天分分析儀器廠)；Varian Mercury-VX 400型核磁共振儀(美國瓦里安公司)；Thermo LTQ XL液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜儀(美國熱電公司)。試驗中所使用的主要試劑：2-氨基苯并咪唑、3-甲基苯甲醛、4-甲基苯甲醛、3-氟苯甲醛、4-氟苯甲醛、3-氯苯甲醛、4-氯苯甲醛、3-溴苯甲醛、4-溴苯甲醛、3,4-二氯苯甲醛、2,4-二氯苯甲醛、3,5-二氯苯甲醛、2,4-二氯苯甲醛(均為化學(xué)純，國藥集團(tuán))，除特別注明外，均未經(jīng)進(jìn)一步處理直接使用。

1.2 合成方法

1.2.1 目標(biāo)化合物N-(3-甲基芐基)-1H-苯并[d]咪唑-2-胺(1)的合成

將2-氨基苯并咪唑1.50 g(11.27 mmol)及3-甲基苯甲醛1.37 g (11.42 mmol)加入到100 mL的單口瓶中，然后加入氯化鋅80 mg，量取45 mL無水甲醇加入到上述反應(yīng)瓶中攪拌溶解。將反應(yīng)液升溫至回流，TLC檢測跟蹤反應(yīng)進(jìn)程，石油醚∶乙酸乙酯=1∶1 (體積比)為展開劑。在反應(yīng)過程中，發(fā)現(xiàn)反應(yīng)溶液由無色逐漸變?yōu)辄S色，經(jīng)TLC檢測，有新點(diǎn)產(chǎn)生，反應(yīng)11 h后，發(fā)現(xiàn)反應(yīng)難以進(jìn)行完全。停止加熱，將反應(yīng)溶液冷卻至室溫，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)脫溶，得到黃色固體2.95 g。將上述黃色固體用6 mL乙酸乙酯溶解，加入適量硅膠拌勻，采用300～400目的硅膠進(jìn)行柱層析，洗脫劑：石油醚∶乙酸乙酯=5∶1 (體積比)，收集僅含有產(chǎn)物點(diǎn)的洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)脫溶，最后得到中間體N-(1H-苯并[d]咪唑-2-基)-1-取代苯基甲亞胺，黃色固體0.757 g，產(chǎn)率29%。稱取上述中間體N-(1H-苯并[d]咪唑-2-基)-1-取代苯基甲亞胺600 mg (2.55 mmol)、硼氫化鈉308 mg (7.65 mmol)，量取甲醇30 mL一并加入到100 mL單口瓶中，常溫攪拌。攪拌過程中不斷有少量的氣體放出，溶液由黃色逐漸變?yōu)闊o色。反應(yīng)3 h后，TLC檢測，展開劑為石油醚∶乙酸乙酯=1∶2 (體積比)，反應(yīng)完畢，此時溶液顏色為粉紅色。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)脫溶后，加入50 mL乙酸乙酯溶解，用30 mL飽和食鹽水洗滌。然后將有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥，抽濾，濾液旋蒸除去溶劑，所得到的固體經(jīng)柱層析純化，洗脫劑：石油醚∶乙酸乙酯=5∶1 (體積比)，得到淡黃色固體0.331 g。產(chǎn)率 55%，mp：139～143 ℃。1H NMR(DMSO, 400 MHz)，δ：2.28 (s, 3H, CH3)，4.48 (d, 2H,J=8.0 Hz, CH2)，6.85～7.18 (m, 9H, ArH)，10.80 (s, 1H,NH)。MS (ESI)：238 (M+1)+。

1.2.2 目標(biāo)化合物N-(4-甲基芐基)-1H-苯并[d]咪唑-2-胺(2)的合成

參照 1.2.1節(jié)目標(biāo)化合物(1)的合成方法得到N-(4-甲基芐基)-1H-苯并[d]咪唑-2-胺(2)，白色固體，產(chǎn)率88%，mp：175～178 ℃。1H NMR (DMSO,400 MHz)，δ：2.26 (s, 3H, CH3)，4.46 (d, 2H,J=8.0 Hz,CH2)，6.84～7.27 (m, 9H, ArH)，10.79 (s, 1H, NH)。MS (ESI)：238 (M+1)+。

1.2.3 目標(biāo)化合物N-(3-氟芐基)-1H-苯并[d]咪唑-2-胺(3)的合成

參照 1.2.1節(jié)目標(biāo)化合物(1)的合成方法得到N-(3-氟芐基)-1H-苯并[d]咪唑-2-胺(3)，淡黃色固體，產(chǎn)率83%。mp：134～136 ℃。1H NMR (DMSO,400 MHz)，δ：4.54 (d, 2H,J=8.0 Hz, CH2)，6.86～7.39(m, 9H, ArH)，10.88 (s, 1H, NH)。MS (ESI)：242(M+1)+。

1.2.4 目標(biāo)化合物N-(4-氟芐基)-1H-苯并[d]咪唑-2-胺(4)的合成

參照1.2.1節(jié)目標(biāo)化合物(1)的合成方法得到N-(4-氟芐基)-1H-苯并[d]咪唑-2-胺(4)，淡黃色固體，產(chǎn)率76%，mp：166～169 ℃。1H NMR (DMSO, 400 MHz)，δ：4.49 (d, 2H,J=8.0 Hz, CH2)，6.85～7.43 (m, 9H, ArH)，10.83 (s, 1H, NH)。MS (ESI)：242 (M+1)+。

1.2.5 目標(biāo)化合物N-(3-氯芐基)-1H-苯并[d]咪唑-2-胺(5)的合成

參照1.2.1節(jié)目標(biāo)化合物(1)的合成方法得到N-(3-氯芐基)-1H-苯并[d]咪唑-2-胺(5)，淡黃色固體，產(chǎn)率78%，mp：160～164 ℃。1H NMR (DMSO, 400 MHz)，δ：4.52 (d, 2H,J=8.0 Hz, CH2)，6.85～7.43 (m, 9H, ArH)，10.89 (s, 1H, NH)。MS (ESI)：258 (M+1)+。

1.2.6 目標(biāo)化合物N-(4-氯芐基)-1H-苯并[d]咪唑-2-胺(6)的合成

參照 1.2.1節(jié)目標(biāo)化合物(1)的合成方法得到N-(4-氯芐基)-1H-苯并[d]咪唑-2-胺(6)，白色固體，產(chǎn)率78%，mp：169～174 ℃。1H NMR (DMSO, 400 MHz)，δ：4.50 (d, 2H,J=4.0 Hz, CH2)，6.79～7.41 (m, 9H,ArH)，10.86 (s, 1H, NH)。MS (ESI)：258 (M+1)+。

1.2.7 目標(biāo)化合物N-(3-溴芐基)-1H-苯并[d]咪唑-2-胺(7)的合成

參照 1.2.1節(jié)目標(biāo)化合物(1)的合成方法得到N-(3-溴芐基)-1H-苯并[d]咪唑-2-胺(7)，白色固體，產(chǎn)率75%，mp：161～165 ℃。1H NMR (DMSO, 400 MHz)，δ：4.52 (d, 2H,J=4.0 Hz , CH2)，6.85～7.56 (m, 9H,ArH)，10.88 (s, 1H, NH)。MS (ESI)：303 (M+1)+。

1.2.8 目標(biāo)化合物N-(4-溴芐基)-1H-苯并[d]咪唑-2-胺(8)的合成

參照 1.2.1節(jié)目標(biāo)化合物(1)的合成方法得到N-(4-溴芐基)-1H-苯并[d]咪唑-2-胺(8)，白色固體，產(chǎn)率52%，mp：187～191 ℃。1H NMR (DMSO，400 MHz)，δ：4.48 (d, 2H,J=4.0 Hz，CH2)，6.84～7.52 (m,9H, ArH)，10.86 (s, 1H, NH)。MS (ESI)：303 (M+1)+。

1.2.9 目標(biāo)化合物N-(3,4-二氯芐基)-1H-苯并[d]咪唑-2-胺(9)的合成

參照 1.2.1節(jié)目標(biāo)化合物(1)的合成方法得到N-(3,4-二氯芐基)-1H-苯并[d]咪唑-2-胺(9)，白色固體，產(chǎn)率73%，mp：212～216 ℃。1H NMR (DMSO,400 MHz)，δ：4.51 (d, 2H,J=8.0 Hz , CH2)，6.85～7.61(m, 8H, ArH)，10.89 (s, 1H, NH)。MS (ESI)：293(M+1)+。

1.2.10 目標(biāo)化合物N-(2,4-二氯芐基)-1H-苯并[d]咪唑-2-胺(10)的合成

參照 1.2.1節(jié)目標(biāo)化合物(1)的合成方法得到N-(2,4-二氯芐基)-1H-苯并[d]咪唑-2-胺(10)，白色固體，產(chǎn)率 64%，mp：193～197 ℃。1H NMR (DMSO,400 MHz)，δ：4.56 (d, 2H,J=4.0 Hz , CH2)，6.87～7.61 (m,8H, ArH)，10.90 (s, 1H, NH)。MS (ESI)：293 (M+1)+。

1.2.11 目標(biāo)化合物N-(3,5-二氯芐基)-1H-苯并[d]咪唑-2-胺(11)的合成

參照 1.2.1節(jié)目標(biāo)化合物(1)的合成方法得到N-(3,5-二氯芐基)-1H-苯并[d]咪唑-2-胺(11)，白色固體，產(chǎn)率 60%，mp：156～160 ℃。1H NMR (DMSO,400 MHz)，δ：4.53 (d, 2H,J=4.0 Hz, CH2)，6.86～7.46(m, 8H, ArH)，10.93 (s, 1H, NH)。MS (ESI)：293(M+1)+。

1.2.12 目標(biāo)化合物N-(2,4-二羥基芐基)-1H-苯并[d]咪唑-2-胺(12)的合成

參照 1.2.1節(jié)目標(biāo)化合物(1)的合成方法得到N-(2,4-二羥基芐基)-1H-苯并[d]咪唑-2-胺(12)，白色固體，產(chǎn)率 71%，mp：146～150 ℃。1H NMR(DMSO, 400 MHz)，δ：4.49 (d, 2H,J=8.0 Hz, CH2)，6.19～7.28 (8H, ArH)，9.12 (s, 1H, OH)，10.94 (s, 1H,NH)，11.76 (s, 1H, OH)。MS (ESI)：256 (M+1)+。

1.3 活性測定

1.3.1 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)：馬鈴薯20 g，瓊脂20 g，葡萄糖20 g，滅菌蒸餾水1 000 mL。

1.3.2 試驗菌種

灰霉病病原菌(Botrytis cinerea)，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)提供。

1.3.3 目標(biāo)化合物對病原菌的毒力測定

采用菌絲生長速率法[18]測定目標(biāo)化合物對灰霉病病原菌菌絲的生長抑制作用。將每個目標(biāo)化合物均用丙酮配制成0.5、5、50 μg/mL的待測溶液，測定其對灰霉病病原菌的抑制活性。在無菌操作臺上，用移液槍取 1 mL配制好的樣品溶液分別加入到培養(yǎng)皿中，用丙酮作空白對照，然后用無菌玻璃注射器注射9 mL融化好的培養(yǎng)基，使藥液與培養(yǎng)基充分混合均勻，放置并冷卻到室溫。然后在培養(yǎng)皿中間位置接種病原菌，每個處理重復(fù)3次，最后將培養(yǎng)皿放入28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)3 d后，利用十字交叉法測出菌落直徑，計算直徑的平均值。最后根據(jù)菌落的平均直徑計算抑菌率[19]。

按照以上方法測定所合成的 12個目標(biāo)化合物的抑菌率。

2 結(jié)果與討論

目標(biāo)化合物1-l2對灰霉病病原菌的活性測試結(jié)果如表1所示。

表1 目標(biāo)化合物1-l2對灰霉病病原菌的抑菌率(%)

續(xù)表1

從表1可以看出，濃度在50 μg/mL時，所有化合物對灰霉病病原菌均有一定的抑制活性。2-氨基苯并咪唑衍生物中N取代芐基苯環(huán)對位溴取代的化合物8活性最低，抑菌率為30%；苯環(huán)甲基取代的化合物1和2活性相對較低，分別為37%和31%；苯環(huán)氯取代的化合物5和6的抑菌活性相近，分別為 46%和 50%；在苯環(huán)二氯取代化合物中，3,4-位二取代的化合物 9的抑菌活性分別高于 2,4-位和3,5-位取代化合物10和11的抑菌活性。化合物4、7、9的抑菌活性超過50%，化合物9活性最高達(dá)到60%，這些化合物可以進(jìn)一步詳細(xì)研究。

3 結(jié) 語

本研究針對2-氨基苯并咪唑的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，利用活性結(jié)構(gòu)拼合的原理，設(shè)計、合成了一類2-氨基苯并咪唑衍生物。以2-氨基苯并咪唑為起始原料，與不同取代的芳醛反應(yīng)生成中間體N-(1H-苯并[d]咪唑-2-基)-1-取代苯基甲亞胺，然后用硼氫化鈉還原得到12個目標(biāo)產(chǎn)物。該合成方法原料易得，反應(yīng)條件容易控制，所有合成的目標(biāo)化合物經(jīng)1H NMR及MS表征確認(rèn)。通過菌落直徑法初步研究了該類化合物對灰霉病病原菌的抑菌活性，結(jié)果表明所有目標(biāo)化合物在50 μg/mL時對灰霉病病原菌具有一定的抑菌活性，化合物4、7、9的抑菌活性超過50%，化合物9活性最高達(dá)到60%。以上這些化合物可以進(jìn)一步衍生化，進(jìn)行結(jié)構(gòu)與活性關(guān)系研究，希望開發(fā)出對灰霉病病原菌具有較高活性的新化合物。