節(jié)瓜CqWRKY31的互作蛋白篩選與鑒定

閆晉強(qiáng) 王 敏 彭慶務(wù) 劉文睿 江 彪 謝大森 何曉明*

（1 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，廣東廣州 510640；2 廣東省蔬菜新技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510640）

節(jié) 瓜（Cogn.var.-How.）是葫蘆科冬瓜屬冬瓜種的變種，是我國嶺南地區(qū)特產(chǎn)蔬菜，在廣東、廣西、海南等地普遍栽培，產(chǎn)品除供應(yīng)本地市場，還大量外銷港澳和東南亞等地區(qū)（謝大森 等，2006；康德賢 等，2013）。由尖孢鐮孢菌（）引起的枯萎病是節(jié)瓜生產(chǎn)中的主要病害，嚴(yán)重影響節(jié)瓜的產(chǎn)量和商品性。由于節(jié)瓜資源相對較少，遺傳背景狹窄，缺乏枯萎病抗性材料。鐮刀菌酸（fusaric acid，F(xiàn)A）是尖孢鐮孢菌代謝過程分泌的毒素（Kuo &Scheffer，1964），是引起枯萎病的重要致病因子（蔣荷 等，2013）。何曉明等（2009）利用FA 脅迫節(jié)瓜不定芽獲得抗FA 再生植株，這些FA 抗性材料同樣具有枯萎病抗性。通過現(xiàn)代生物技術(shù)手段獲得抗性材料，明確抗性材料的抗病機(jī)理對節(jié)瓜枯萎病抗性育種具有重要意義。

WRKY 轉(zhuǎn)錄因子是最大的基因家族之一，容易受到外界環(huán)境的刺激誘導(dǎo)表達(dá)，廣泛參與植物響應(yīng)生物與非生物脅迫多個(gè)過程（Jiang et al.，2017）。例如，通過轉(zhuǎn)錄組分析大豆感染銹病不同時(shí)間的基因表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)16 個(gè)WRKY 轉(zhuǎn)錄因子在銹病感染前后表達(dá)變化顯著（Bencke-Malato et al.，2014），表明這些WRKY 轉(zhuǎn)錄因子可能調(diào)控大豆銹病抗性水平。鹽、HS 和HO脅迫葡萄后，葡萄VvWRKY30 誘導(dǎo)表達(dá)，異源過表達(dá)VvWRKY30 可以提高擬南芥的抗氧化酶活性和抗鹽水平（Zhu et al.，2019）。白楊PalWRKY77 通過抑制ABA 信號途徑相關(guān)基因的表達(dá)，降低白楊耐鹽性（Jiang et al.，2021）；WRKY 轉(zhuǎn)錄因子同樣參與尖孢鐮孢菌引起的植物枯萎病調(diào)控。番茄專化型尖孢鐮孢菌侵染番茄后，通過分析不同WRKY 轉(zhuǎn)錄因子的時(shí)空表達(dá)，發(fā)現(xiàn)16 個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子與枯萎病侵染相關(guān)，其中SlWRKY33 和SlWRKY37 上調(diào)表達(dá)，SlWRKY4 下調(diào)表達(dá)（Aamir et al.，2018）。尖孢鐮孢菌侵染棉花、西瓜等作物后，相關(guān)WRKY 轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平也發(fā)生顯著變化（Guo et al.，2011；Yang et al.，2014）。尖孢鐮孢菌侵染岷江百合后，一些WRKY 轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)發(fā)生變化，其中LrWRKY1 上調(diào)表達(dá)，過表達(dá)LrWRKY1 可以提高岷江百合枯萎病抗性水平（Li et al.，2021）。

酵母雙雜交系統(tǒng)是在酵母體內(nèi)通過重建有活性轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)來鑒定蛋白質(zhì)之間的相互作用。目前為止，已在小麥（魏春茹 等，2020）、水稻（孔蘭 等，2019）、番茄（趙懷印 等，2020）以及草莓（李小龍 等，2019）等多種作物中通過酵母雙雜交技術(shù)成功篩選某一基因或者轉(zhuǎn)錄因子的互作蛋白，為進(jìn)行相關(guān)基因功能研究奠定了理論基礎(chǔ)。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，節(jié)瓜抗性材料A39FA 中CqWRKY31 受FA 誘導(dǎo)表達(dá)，為節(jié)瓜響應(yīng)FA 脅迫的正調(diào)控因子（Mao et al.，2017）。目前為止，CqWRKY31 調(diào)控節(jié)瓜枯萎病（或FA）的抗性機(jī)制尚未解析，發(fā)掘CqWRKY31 的互作蛋白，解析互作蛋白的功能特點(diǎn)，對研究CqWRKY31 的調(diào)控機(jī)制具有重要意義。因此，本試驗(yàn)通過酵母雙雜技術(shù)，篩選CqWRKY31 的互作蛋白，為進(jìn)一步研究CqWRKY31 響應(yīng)FA 脅迫和尖孢鐮孢菌侵染的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所用酵母文庫為廣東省蔬菜新技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存的以冬瓜B227 根、莖、葉、花、幼果為材料構(gòu)建的cDNA 均一化酵母文庫（陳鳳 等，2021）。冬瓜自交系B227 于2019 年春季種植在廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院白云試驗(yàn)基地，在坐果期采取不同組織材料后放置液氮中速凍，于-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩９?jié)瓜抗枯萎病自交系A(chǔ)39 的CqWRKY31 CDS 序列通過全基因合成。

1.2 誘餌載體構(gòu)建

將全基因合成的CqWRKY31 連接到pGBKT7載體得到pGBKT7-CqWRKY31。以pGBKT7-WRKY31 載體為模板，PCR 擴(kuò)增WRKY31-1（引物WRKY31-1-F 和WRKY31-1-R）和WRKY31-2（引物WRKY31-2-F 和WRKY31-2-R），引物信息見表1。PCR 產(chǎn)物和pGBKT7 載體分別經(jīng)RI 和HI 雙酶切、純化后進(jìn)行載體和目的片段連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，將轉(zhuǎn)化出來的單菌落陽性檢測后測序驗(yàn)證。

表1 引物信息

1.3 目的蛋白毒性和自激活活性檢測

目的基因誘餌載體pGBKT7-CqWRKY31/pGADT7 AD、pGBKT7-CqWRKY31-1/pGADT7 AD 和pGBKT7-CqWRKY31-2/pGADT7 AD空載體分別以醋酸鋰（LiAc）法共轉(zhuǎn)Y2H gold（MATα）菌株，涂布SD/-Leu/-Trp 平板。挑取SD/-Leu/-Trp平板上生長較好的單克隆（一般直徑＞2 mm）到SD/-Leu/-Trp 液體培養(yǎng)基中，搖至對數(shù)生長期（29 ℃、200 r·min、200 h），點(diǎn)板到SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp 平板。結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)如下：若在SD/-Leu/-Trp 平板和SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp 平板上都無菌斑，表明目的蛋白有毒性；若在SD/-Leu/-Trp平板和SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp 平板上都有菌斑，表明目的蛋白有自激活；在SD/-Leu/-Trp 平板上有白色菌斑，在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp 平板上無菌斑，表明目的蛋白無自激活。

1.4 CqWRKY31 互作蛋白篩選

將無毒性、無自激活的載體LiAc 法轉(zhuǎn)Y2H gold 菌株，涂布SD/-Trp 平板。從SD/-Trp 平板上挑取直徑2～3 mm、攜帶誘餌質(zhì)粒的Y2H gold 單克隆，接入50 mL SD/-Trp 液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，取適量過夜菌液接種于YPDA 培養(yǎng)基（YPD培養(yǎng)基基礎(chǔ)上加入0.003%腺嘌呤硫酸鹽）中培養(yǎng)至OD為0.4～0.6。以PEG/LiAc 法將文庫DNA轉(zhuǎn)化包含誘餌載體的酵母，涂布于SD/-Leu/-Trp二缺平板，選取菌斑大于2 mm 的菌落，打點(diǎn)至SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp 四缺平板，2～3 d 后長出的菌落挑出來做插入片段擴(kuò)增，所用引物5′LD Amplimer 和3′LD Amplimer，序列信息見表1，經(jīng)PCR 擴(kuò)增檢測陽性的菌落進(jìn)行測序分析。

1.5 陽性克隆的回復(fù)雜交驗(yàn)證

挑取陽性克隆培養(yǎng)后抽提質(zhì)粒，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒。取質(zhì)粒和pGBKT-WRKY31-1 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)Y2H gold 酵母感受態(tài)細(xì)胞，涂布SD/-Leu/-Trp 二缺平板，培養(yǎng)3～5 d 后拍照。二缺平板長出的單克隆，涂布SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp 和加有x-α-gal的SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp 四缺平板，5～14 d 后拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 CqWRKY31 誘餌載體的構(gòu)建和自激活檢測

首先，通過全基因合成將節(jié)瓜CqWRKY31 連接到pGBKT7 載體，構(gòu)建pGBKT7-CqWRKY31 載體。pGBKT7-CqWRKY31 經(jīng)RI和HI雙酶切，產(chǎn)生1 098 bp 大小的目的片段條帶和7 294 bp 大小的線性化載體條帶，瓊脂糖凝膠電泳檢測（圖1）與預(yù)期相符，經(jīng)進(jìn)一步測序驗(yàn)證，確定載體正確。將pGBKT7-CqWRKY31/pGADT7 AD 空載體以LiAc 法共轉(zhuǎn)Y2H gold（MATα）菌株，涂布SD/-Leu/-Trp 平板，平板上無菌斑，表明pGBKT7-CqWRKY31 有毒，無法用來篩庫。

圖1 ECORI 和BamHI 對pGBKT7-CqWRKY31 載體雙酶切

截短后分別構(gòu)建pGBKT7-CqWRKY31-1和pGBKT7-CqWRKY31-2，經(jīng)測序無誤后，pGBKT7-CqWRKY31-1/pGADT7 AD 空載體和pGBKT7-CqWRKY31-2/pGADT7 AD 空載體分別以LiAc 法共轉(zhuǎn)Y2H gold（MATα）菌株，涂布SD/-Leu/-Trp 平板。挑取SD/-Leu/-Trp 平板上生長較好的單克隆（一般直徑＞2 mm），挑到SD/-Leu/-Trp 液體培養(yǎng)基中，搖至對數(shù)生長期，點(diǎn)板到SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp 平板。轉(zhuǎn)化陽性對照、陰性對照、pGBKT7-CqWRKY31-1/pGADT7 AD 載體和pGBKT7-CqWRKY31-2/pGADT7 AD 的菌株都可以在SD/-Leu/-Trp 平板上生長，表明pGBKT7-CqWRKY31-1 和pGBKT7-CqWRKY31-2無毒（圖2）。轉(zhuǎn)化陽性對照和pGBKT7-CqWRKY31-2/pGADT7 AD 載體的菌株可以但轉(zhuǎn)化陰性對照和pGBKT7-CqWRKY31-1/pGADT7 AD 的菌株不可以在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp 平板上生長，表明pGBKT7-CqWRKY31-2 表達(dá)的融合蛋白有自激活，pGBKT7-CqWRKY31-1 表達(dá)的融合蛋白無自激活（圖2），pGBKT7-CqWRKY31-1 可用于后續(xù)篩庫。

圖2 pGBKT7-CqWRKY31-1 和pGBKT7-CqWRKY31-2 載體自激活和毒性驗(yàn)證

2.2 CqWRKY31 互作蛋白的篩選

以pGBKT7-CqWRKY31-1為誘餌蛋白與冬瓜均一化cDNA 酵母文庫進(jìn)行雜交，將可以在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp 平板上生長的菌落挑出做插入片段PCR 擴(kuò)增，并對PCR 產(chǎn)物進(jìn)行測序，得到45個(gè)與節(jié)瓜CqWRKY31 有潛在互作關(guān)系的蛋白。

2.3 CqWRKY31 酵母雙雜交回轉(zhuǎn)驗(yàn)證

陽性克隆質(zhì)粒與pGBKT7-CqWRKY31-1 共轉(zhuǎn)化Y2H gold 酵母感受態(tài)細(xì)胞，涂布SD/-Leu/-Trp二缺平板，培養(yǎng)3～5 d，拍照。二缺平板長出的單克隆，涂布SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp 和SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp（x-α-gal）四缺平板，5～14 d 后拍照。除陰性對照外，所有45 個(gè)共轉(zhuǎn)化的菌株和陽性對照均可以在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp 四缺平板上正常生長。除陰性對照和3 個(gè)共轉(zhuǎn)化菌株（編號22、23 和28）外，其余42 個(gè)共轉(zhuǎn)化菌株均可在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp（x-α-gal）平板上生長（圖3），表明這42 個(gè)蛋白與CqWRKY31 在酵母中存在相互作用關(guān)系（表2）。在這42 個(gè)互作蛋白中，包括10 個(gè)SRC2 或SRC2 同源蛋白、3 個(gè)E3 泛素蛋白連接酶、6 個(gè)DNA 損傷誘導(dǎo)蛋白、3 個(gè)AT-hook核定位蛋白等。

圖3 45 種蛋白與CqWRKY31 互作的回轉(zhuǎn)驗(yàn)證

表2 CqWRKY31 的42 種潛在互作蛋白Blast 比對結(jié)果

3 討論與結(jié)論

WRKY 類轉(zhuǎn)錄因子廣泛參與植物生物和非生物脅迫響應(yīng)進(jìn)程。Mao 等（2017）前期報(bào)道，CqWRKY31 可能為節(jié)瓜響應(yīng)鐮刀菌酸脅迫的正調(diào)控因子。經(jīng)Blast 比對分析，節(jié)瓜CqWRKY31 與冬瓜基因組中BhWRKY41為同一基因，與甜瓜、南瓜和擬南芥WRKY41 同源。擬南芥WRKY41 過表達(dá)影響植株對不同病原菌的抗性水平（Higashi et al.，2008）。棉花WRKY41 與擬南芥WRKY41同源，可能通過調(diào)節(jié)氣孔關(guān)閉、活性氧（ROS）清除和抗氧化基因的表達(dá)來增強(qiáng)植物對逆境的耐受性（Chu et al.，2015）。

鑒于CqWRKY31 的基因功能尚不清楚，本試驗(yàn)通過構(gòu)建誘餌載體進(jìn)行酵母雙雜交篩選CqWRKY31 的潛在互作蛋白并進(jìn)行回復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)。CqWRKY31 蛋白全長為361 aa，由于整個(gè)WRKY31 蛋白有毒性，無法用來后續(xù)篩庫，因此選擇CqWRKY31 的2 個(gè)部分序列CqWRKY31-1 和CqWRKY31-2 進(jìn)行后續(xù)分析。CqWRKY31-1 片段對應(yīng)CqWRKY31 蛋白129～191 aa，CqWRKY31-2片段對應(yīng)CqWRKY31蛋白192～361aa。CqWRKY31-1包含完整的CqWRKY31蛋白的WRKY保守結(jié)構(gòu)域（130～190aa），因此，CqWRKY31-1 可以代表CqWRKY31 基因的主要蛋白功能。經(jīng)過酵母文庫篩選和回復(fù)驗(yàn)證，共篩選到42 個(gè)與CqWRKY31 在酵母中有互作關(guān)系的蛋白。在這42 個(gè)互作蛋白中，包括10 個(gè)SRC2 或SRC2同源蛋白、3 個(gè)E3 泛素蛋白連接酶、6 個(gè)DNA 損傷誘導(dǎo)蛋白、3 個(gè)AT-hook 核定位蛋白等。SRC2和SRC2 同源基因在植物應(yīng)對非生物脅迫和宿主、非宿主病原菌侵染過程中起著重要的作用。擬南芥冷誘導(dǎo)蛋白SRC2 在低溫脅迫下誘導(dǎo)表達(dá)，該基因通過增強(qiáng)ROS 的產(chǎn)生，提升植物應(yīng)對低溫脅迫的能力（Kawarazaki et al.，2013）。辣椒-在細(xì)菌、病毒侵染，CaCl、低溫處理后表達(dá)水平顯著提高，表明-在植物應(yīng)對非生物、生物脅迫過程發(fā)揮了重要作用（Kimet al.，2008）。辣椒疫霉屬于elicitin 基因家族，可以誘導(dǎo)植物超敏性程序性細(xì)胞死亡。酵母雙雜交發(fā)現(xiàn)辣椒SRC2-1 與互作，基因沉默SRC2-1可以提升辣椒對辣椒疫霉的抗性水平（Liuet al.，2015）。在大豆中，克羅莫結(jié)構(gòu)域蛋白LHP1 通過與WRKY40 啟動子結(jié)合和降低大豆內(nèi)源水楊酸含量兩種方式抑制WRKY40 的表達(dá)水平，進(jìn)而負(fù)調(diào)控大豆對大豆疫霉的抗性（Zhang et al.，2021）。此外，張慧媛等（2018）發(fā)現(xiàn)小麥耐鹽相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子WRKY33 與葉綠素a-b 結(jié)合蛋白及泛素結(jié)合酶等有互作關(guān)系，表明WRKY33 可能通過與這些蛋白互作調(diào)控小麥的耐鹽性。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，克羅莫結(jié)構(gòu)域蛋白LHP1、葉綠素a-b 結(jié)合蛋白和E3 泛素蛋白連接酶同樣與CqWRKY31在酵母中存在互作關(guān)系。

綜上所述，本試驗(yàn)篩選到與CqWRKY31 存在互作關(guān)系的蛋白，進(jìn)一步結(jié)合互作蛋白的功能注釋和前人研究結(jié)果，發(fā)現(xiàn)CqWRKY31 可能與SRC2、LHP1、葉綠素a-b 結(jié)合蛋白和E3 泛素蛋白連接酶通過蛋白互作調(diào)控節(jié)瓜的FA 抗性，為揭示CqWRKY31 介導(dǎo)的節(jié)瓜響應(yīng)FA 脅迫機(jī)制提供了新的線索。