基于GC-MS/PFPD對不同完熟期克里曼丁橘汁風味組分分析

程玉嬌，李貴節，歐陽祝，吳厚玖，梁國魯，王華*

1(西南大學 柑桔研究所，重慶，400712)2(國家柑桔工程技術研究中心，重慶，400712) 3(西南大學 園藝園林學院，重慶，400715)

寬皮柑橘(Citrusreticulata)是一類果皮寬松、皮薄易剝且風味獨特的柑橘品種，主要分布在中國、歐盟和土耳其等國。據美國農業部數據統計[1]，近5年全球寬皮柑橘產量約3 000萬t/年，其中我國寬皮柑橘產量約占全球的70%。目前，我國寬皮柑橘主要用于鮮食，少量加工成果汁、罐頭、精油和蜜餞等產品。隨著我國寬皮柑橘鮮食市場的飽和，將寬皮柑橘鮮果加工成果汁，滿足消費者的需求，實現我國寬皮柑橘產業升級，將具有重要的意義。寬皮柑橘品種繁多，其中，克里曼丁橘是一類具有代表性的寬皮柑橘品種，因果肉多汁、無籽、有特殊香味等特點，受到越來越多消費者的喜愛。目前，克里曼丁橘已廣泛引種在我國湖南安化[2]、廣西桂林[3]、重慶奉節[4]等地，品質穩定，具有很好的加工適宜性。

風味是衡量柑橘果汁品質的重要指標。近年來，針對寬皮柑橘風味的研究較多。XIAO等[5]采用氣相色譜-質譜(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)在5種寬皮柑橘汁中檢測到49種揮發性組分，其中壬醛、己醛、芳樟醇和D-檸檬烯是對寬皮柑橘果汁整體風味具有重要貢獻的化合物。FENG等[6]發現芳樟醇、辛醛、α-蒎烯、D-檸檬烯和(E,E)-2，4-癸二烯醛是寬皮柑橘汁區別于橙汁風味的關鍵組分。此外，本團隊前期采用GC-MS結合脈沖火焰檢測器(pulsed flame photometric detector，PFPD)在鮮榨寬皮柑橘汁中檢測到4種具有特殊氣味屬性的揮發性硫化物(volatile sulfur compounds，VSCs)：羰基硫、硫化氫、二甲基硫醚、二硫化碳，證明了具有濃度低、閾值低、化學性質活潑的VSCs是影響寬皮柑橘果汁風味的異味組分[7]。

在不同成長或成熟階段，柑橘水果的大小、顏色、口感、風味，都發生顯著變化?？扇苄怨绦挝?soluble solids content，SSC)和總酸(total acid，TA)作為柑橘水果成熟的標志。RANGANNA等[8]研究表明當SSC和TA比值在8.6～18.1時，可規定為寬皮柑橘的最佳成熟期(完熟期)。HIJAZ等[9]發現隨著SSC/TA的增加，寬皮雜柑默科特、411、Temple、LB8-9水果的甜度、成熟度和多汁性增加，而酸味和苦味降低。隨著消費者對柑橘水果的“高品質”追求，除SSC和TA外，風味成為消費者選擇柑橘水果或產品的關鍵因素。柑橘風味呈現與揮發性組分的種類和含量密不可分，然而，關于水果成熟期間風味變化的研究多集中在桃[10]、番茄[11]、西番蓮[12]等水果，針對不同成熟期寬皮柑橘汁風味變化的研究報道有限。康明麗等[13]采用GC-MS在未成熟、充分成熟、過熟的大葉尾張蜜柑汁中分別檢測到34、32、33種揮發性成分，其中，醇類、醛類、酯類揮發性成分在充分成熟果中含量最高，而烴類成分在成熟果中含量最低。HIJAZ等[9]發現默科特柑橘果中醋酸甲酯和乙酸乙酯含量隨著成熟度增加而增大。前期文獻研究僅對不同成熟期寬皮柑橘水果中揮發性組分進行了測定，主要目的是為了明確具有良好風味品質寬皮柑橘的采摘期，促進鮮果銷售，然而，關于不同完熟期寬皮柑橘鮮果的加工特性，尤其是風味特性，還未進行全面探究。

為了明確不同完熟期寬皮柑橘汁的特征風味組分及其在加工中的變化規律，本研究擬以5個不同完熟度克里曼丁橘為研究對象，利用頂空固相微萃取(head spcase solid phase micro extraction，HS-SPME)結合GC-MS/PFPD對克里曼丁橘汁中揮發性組分進行定性和定量分析，采用主成分分析(principal component analysis，PCA)和氣味活性值(odor activity value，OAVs)探究完熟期與揮發性組分之間的關系、不同完熟期克里曼丁橘汁中特征風味組分及其加工中的變化規律，為明確我國具有加工適宜性的克里曼丁橘采摘期提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗材料

5個不同成熟度的克里曼丁橘采自重慶市中國農業科學院柑桔研究(西南大學柑桔研究所)國家種植柑橘資源圃，采摘信息見表1。由于克里曼丁橘的SCC/TA為11.06～18.09，屬于完熟期水果。

表1 柑橘樣品采摘信息表Table 1 The picking information of citrus sample

1.1.2 實驗試劑

C5～C20正構烷烴，美國Honeywell公司；環己酮(純度99%)、甲基乙基硫醚(純度96%)，上海阿拉丁公司。

1.2 儀器與設備

Agilent 7890B GC-5977A MS氣相色譜-質譜聯用儀、RTX-wax色譜柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm)，美國安捷倫科技有限公司；OI 5380 PFPD脈沖火焰光度檢測儀，美國OI公司；H-100-DWBIA0惠人榨汁機，上海韓惠人愛家電科技有限公司；DouR@SPT-H氮空吹掃濃縮儀，北京斯珀特科技有限公司；Milli-Q超純水系統，德國Merck-Millpore公司；SQP十萬分之一天平，北京賽多利斯科學儀器有限公司；50/30 μm 二乙烯基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷萃取頭(DVB/CAR/PDMS)萃取頭，美國Supelco公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，上海力辰科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品制備

鮮榨柑橘汁的制備：將采摘的庫里曼丁橘手動去皮，采用壓榨機將果肉壓榨出汁，果汁被分為2組：鮮榨組(F組)和加工組(H組)，F組直接進行檢測分析。H組：根據果汁工業加工條件[14]，將果汁樣品進行加熱處理，使果汁中心溫度達到98 ℃維持15 s，隨后裝瓶、冷卻，置于-20 ℃待用。F1、F2、F3、F4、F5和H1、H2、H3、H4、H5分別表示完熟期1～晚熟期5的鮮榨組和加工組果汁。

1.3.2 揮發性組分的測定

將5 mL鮮榨果汁置于含有磁子的20 mL頂空瓶中，加入內標環己酮2.5 μL(9.423 mg/mL)和甲基乙基硫醚1.5 μL(8.42 mg/mL)，混勻，采用聚四氟乙烯材質的隔墊密封。將頂空瓶置于40 ℃水浴中平衡20 min，采用2 cm的50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取頭插入頂空瓶中，萃取揮發性組分30 min。

GC-MS/PFPD測定條件，參考程玉嬌[15]方法，略有修改。采用安捷倫7890B GC-5977A MS/OI5380 PFPD設備對果汁中的揮發性組分進行測定，將備好的萃取頭置于GC進樣口200 ℃解析5 min，揮發性組分在RTX-wax色譜柱上進行分離后進入MS和PFPD檢測器進行測定。柱溫設置程序：初始溫度為35 ℃，保持6 min，7 ℃/min升至203 ℃，保持10 min。載氣為氦氣，流速為1.5 mL/min。EI離子源的電子能量為70 eV，傳輸線溫度設置為280 ℃。m/z掃描范圍為33～500 mau。PFPD檢測器的溫度設置為250 ℃，PMT電壓為498 V，載氣和燃氣分別為氦氣、空氣和氫氣。每個樣品重復3次。

1.3.3 定性和定量分析

定性分析：克里曼丁果汁中的揮發性非硫組分的定性主要通過匹配NIST11、W10 N14庫中MS總離子流、與已發表文獻中的線性保留指數(linear retention index，LRI)比較，其中線性保留指數是通過正構烷烴C5～C20進行計算?？死锫」械膿]發性硫組分的定性方式除上述方法外，可通過PFPD進行再次定性。

定量分析：揮發性非硫組分的定量主要通過內標環己酮進行，而揮發性硫組分的定量主要通過內標甲基乙基硫醚進行。定量計算如公式(1)所示：

(1)

式中：C待，待測揮發性組分的質量濃度，μg/mL；A待，待測揮發性組分的峰面積；C，內標質量濃度；A內標，內標組分在MS或PFPD上的峰面積。

1.3.4 OAV計算

OAV為風味組分的濃度與感官閾值的比值。通常當OAV≥1時，表明該風味組分對果汁的整體風味具有貢獻[16]。

1.3.5 數據處理

采用SPSS 25.0對數據進行方差分析和Duncan多重檢驗；化學工作站F.01.01.2317對揮發性組分進行定性分析。采用Origin 7.5繪圖和Unscrambler 10.4軟件進行PCA分析。

2 結果與分析

2.1 不同完熟期克里曼丁橘汁中揮發性組分的定性分析

采用MS和PFPD 2種不同檢測器，對不同完熟期的克里曼丁橘汁中揮發性組分進行檢測，其中MS檢測器可對揮發性組分進行全面檢測，而本文中PFPD檢測器主要檢測硫組分，且VSCs在PFPD的響應值遠高于MS檢測器。如圖1所示，由于VSCs在克里曼丁橘汁中含量極低，僅能通過PFPD進行檢測，而在MS檢測器上無法檢測到VSCs信號，此外，其他的揮發性非硫組分在MS檢測器上都具有很好的響應。

a-MS圖譜：b-PFPD圖譜圖1 采用GC-MS/PFPD對克里曼丁紅橘果汁中揮發性組分檢測色譜圖Fig.1 The chromatography of volatile compounds in clementine juice by GC-MS/PFPD

通過匹配檢測的揮發性組分與NIST11、W10 N14庫中MS總離子流、比較與已發表文獻中的LRI及PFPD硫檢測器信號值，不同完熟期間的克里曼丁橘汁中揮發性組分的定性分析結果如表2所示，共41種揮發性組分被檢測，包括萜烯類(16種)、醇類(8種)、醛類(8種)、酮類(2種)、酯類(2種)、揮發性硫化物類(3種)及其他種類(2種)。在不同完熟期間，克里曼丁橘汁中揮發性組分種類呈現變化，如圖2所示，萜烯類組分是寬皮橘汁中最主要的揮發性組分，其在F5組中種類最少(13種)，在F3和H4中種類最高(16種)；醛類和酯類組分對寬皮橘汁風味具有重要的貢獻，這兩類風味組分在完熟期4中種類最多，且(E)-己烯醛和辛醛僅在此完熟期檢測到；醇類和VSCs在不同晚熟期間，克里曼丁橘汁中的種類并未發生變化。乙酸乙酯和丁酸甲酯2種酯類物質在克里曼丁橘汁中檢測到。通過比較完熟期1和完熟期5階段，隨著成熟度增加，克里曼丁橘汁中萜烯類物質檢測到的種類減少，醛類、酯類和酮類物質檢測的種類增加，這也與前期的文獻報道趨勢一致[13]。此外，在鮮榨組F1、F2、F3、F4、F5中，分別檢測到29種、33種、35種、37種、32種揮發性組分；在加工組H1、H2、H3、H4、H5中，分別檢測到30種、34種、35種、39種、36種揮發性組分。除完熟期3階段外，加工促進其他完熟期克里曼丁橘汁中揮發性組分種類的提高，主要體現在加工促進了甲硫醇和甲硫醚產生，導致異味形成[7]。

2.2 不同完熟期克里曼丁橘汁中揮發性組分的定量分析

采用內標環己酮和甲基乙基硫醚，分別對不同完熟期克里曼丁橘汁中揮發性組分進行定量分析，結果如圖3所示，在5個不同的完熟階段，乙酸乙酯的含量呈現上升趨勢，羅勒烯的含量呈現下降趨勢。此外，克里曼丁橘汁中的其他揮發性組分含量僅在某個成熟階段呈現規律變化，這與CHAUDHARY等[17]研究紅葡萄柚在可食成熟期揮發性組分的含量變化規律一致。

在5個不同完熟階段中克里曼丁橘汁中揮發性組分含量變化呈現不同趨勢。其中，萜烯類組分是寬皮橘汁中最主要的一類揮發性組分，對果汁的風味具有重要的影響[18]，克里曼丁橘汁中萜烯類組分的含量約占所檢測的所有揮發性組分的91.89%～96.63%，其占比在不同完熟期1～晚熟期4呈現降低趨勢(96.63%至91.89%)，而在完熟階段5略有上升；在本研究中，D-檸檬烯(83.67%～87.94%)和β-月桂烯(3.65%～5.53%)是克里曼丁橘汁中含量最高的2種萜烯類組分，其中，在不同完熟期，這2種揮發性組分的變化呈現不同趨勢，D-檸檬烯含量呈現下降趨勢(完熟期1～完熟期4)，且不同完熟期之間差異極顯著(P<0.01)，而β-月桂烯含量變化未呈現明顯規律；此外，加工促進了克里曼丁橘汁中萜烯類組分含量增加，其中完熟期4萜烯類含量增加最為顯著。柑橘中醇類、醛類和酮類3種含氧類的化合物均來自不飽和脂肪酸的過氧化作用[19]，在本研究中，克里曼丁橘汁中醇類含量總和僅次于萜烯類化合物，其占比在不同完熟期(3～5)呈現上升趨勢(3.47%～6.01%)，其中芳樟醇是克里曼丁橘汁中含量最高(1.68%～3.63%)的醇類化合物，在不同完熟階段均有檢出；4-萜品烯醇和α-松油醇常被用來衡量柑橘汁在加工過程中風味品質變化，被認為是導致風味失衡的重要因素[20]，本研究中，加工促進4-萜品烯醇和α-松油醇含量升高，在完熟期4含量增長最低?？死锫￠僦腥╊惡績H次于萜烯類和醇類組分，在完熟期1～完熟期4，其含量占比呈現上升趨勢，在完熟期5稍有下降；乙醛常被認為是鮮果貯藏過程中重要的異味組分，是由丙酮酸經丙酮酸脫羧酶脫羧形成，在寬皮柑橘鮮果貯藏期間，乙醛含量逐漸升高[21]。在本研究中，克里曼丁橘汁中正己醛在完熟期1→完熟期4呈現上升趨勢(30.90～165.63 μg/L)；正庚醛僅在完熟期4和完熟期5中檢測到，且含量逐漸升高。丁酸甲酯是克里曼丁橘汁中重要的酯類化合物，僅在完熟期4中檢測到。VSCs在克里曼丁橘汁中濃度極低，在各完熟期呈現不同變化趨勢，其中硫化氫含量在完熟期3達到最高值(1.66±0.02) μg/L，且加工降低了克里曼丁汁中硫化氫的含量；甲硫醇和甲硫醚僅在加工的克里曼丁橘汁中檢測到，在完熟期1～完熟期3呈現上升趨勢，完熟期3～完熟期4呈現下降趨勢，而在完熟期4～完熟期5呈現上升趨勢。檸檬烯環氧物在完熟期5含量最高(1 000±9.02) μg/L，且加工降低了檸檬烯環氧物的含量。此外，通過比較H1和H5中揮發性組分含量，萜烯類(114 218.43～75 290.97 μg/L)和揮發性硫化物化合物(1.68～1.49 μg/L)總含量呈現下降趨勢，而醇類(3 743.87～4 871.99 μg/L)、醛類(334.80～568.42 μg/L)、酯類(0.00～86.19 μg/L)和酮類化合物(0.00～26.62 μg/L)的含量則呈現上升趨勢，這與前期關于不同成熟階段蜜柑果汁[13]、寬皮雜柑類果汁[9]中的變化趨勢一致。

表2 不同成熟期克里曼丁果汁中揮發性組分定性分析Table 2 The identification analysis of volatile compounds in clementine juice at different stages of complete maturity

續表2

圖2 不同完熟期克里曼丁橘汁中揮發性組分變化Fig.2 The varieties change of volatile compounds in clementine juice at different stages of complete maturity

圖3 不同成熟期克里曼丁紅橘果汁中揮發性物質的熱圖Fig.3 The heatmap of volatiles compounds in clementine juice at different stages of complete maturity

2.3 PCA

為進一步明確克里曼丁橘汁中揮發性組分濃度與各個完熟階段之間的關系，采用PCA對各個不同完熟階段的鮮榨果汁(F1、F2、F3、F4、F5)和加工果汁(H1、H2、H3、H4、H5)中揮發性組分進行分析。如圖4所示，主成分1和主成分2的累計貢獻率為72%，保證了數據分析的代表性。PCA結果圖為雙標圖，由得分圖和載荷圖組成。其中得分圖主要是表明哪些樣品具有相似的揮發性組分刨面，即用于表明構造主成分的揮發性組分對能夠區分樣品是否有用。由圖4可知，在PCA得分圖中，除完熟期3外，其他完熟階段的鮮榨果汁組和加工處理組的克里曼丁橘汁樣品點比較集中，可以組合為1個集合且不同集合相互間距顯著。載荷圖主要用來確定用于區分樣品的揮發性組分。在本研究中，32種揮發性組分在PC1和PC2相關分量呈現不同，其中，α-蒎烯(0.98)、D-檸檬烯(0.97)、β-月桂烯(0.96)、β-蒎烯(0.96)、δ-杜松烯(0.96)、4-萜烯醇(0.91)、γ-松油烯(0.88)、β-水芹烯(0.87)、1-辛醇(0.87)、α-松油醇(0.82)、古巴烯(0.78)、紫蘇醛(0.76)、α-萜品烯(0.76)、羅勒烯(0.76)、對傘花烴(0.74)在PC1相關度絕對值分量達到0.7～1.0，對克里曼丁橘汁在X軸上的分布具有重要貢獻，也是區分克里曼丁橘汁完熟期1～完熟期4的主要因素；檜烯(0.87)、α-水芹烯(0.85)、乙酸乙酯(0.85)、檸檬烯環氧化物(0.84)、香茅醇(0.82)、正庚醛(0.81)、芳樟醇(0.79)、1-己醇(0.77)、乙醛(0.76)在PC2上的相關分量絕對值達到0.7～1.0，對克里曼丁橘汁樣品在Y軸上分布具有重要貢獻，即這9種揮發性組分是區分成完熟期5與其他完熟期樣品的主要因素。

圖4 不同完熟階段克里曼丁橘汁中揮發性物質的PCA得分/載荷圖Fig.4 Principal component analysis biplot (score and load values) for volatile compounds in clementine juice at different stages of complete maturity

2.4 不同完熟期的克里曼丁橘汁中風味活性組分分析

為了篩選不同完熟期的克里曼丁橘汁中特征風味組分，明確其對果汁整體風味的貢獻及在加工中變化規律，計算各個風味組分的OAV值，即其濃度與感官閾值的比值。一般認為，OAV值≥1時風味組分對果汁的整體風味具有貢獻，也被認為是果汁的特征風味組分[22]。經查文獻，獲得各個揮發性組分在水中的感官閾值，其中不同完熟期克里曼橘中OAV≥1的揮發性組分如表3所示?？死锫〖t橘果汁中共檢測到29種特征風味組分，其中包括萜烯類(12種)、醇類(4種)、醛類(8種)、酯類(1種)、酮類(1種)、苯類(1種)及其他類(2種)。特征風味組分表現出不同的氣味屬性，即橘香(9種)、花香(3種)、果香(2種)、松香(4種)、青草味(4種)、薄荷味(3種)和異味(4種)，共同組成克里曼丁橘汁風味輪廓。D-檸檬烯(橘香)、β-月桂烯(香脂味)和芳樟醇(花香)是克里曼丁橘汁最主要的特征風味組分。特征風味組分的種類在克里曼丁不同完熟期呈現不同，在鮮榨組F1、F2、F3、F4、F5和加工組H1、H2、H3、H4、H5不同完熟期階段，克里曼丁橘汁中分別檢測到18、15、18、19、18和22、19、20、22、23種特征風味組分。其中，在不同完熟期，醛類特征組分種類變化最大，呈現先升高后降低的趨勢，在完熟期4達到最大值。具有果香的酯類特征風味組分僅在完熟期4中檢測到。此外，加工促進VSCs的產生，導致克里曼丁橘汁中出現異味，與其他3個完熟期相比，完熟期1和完熟期4中VSCs的OAV值明顯降低，且差異顯著(P<0.05)。

3 結論

采用HS-SPME結合GC-MS/PFPD對5個不同完熟階段的克里曼丁鮮榨組和加工組橘汁進行測定，共41種揮發性組分被檢測，萜烯類(91.89%～96.63%)、醇類(3.14%～6.01%)、醛類(0.21%～2.35%)是克里曼丁汁主要的揮發性組分。在不同完熟期間，揮發性組分種類發生變化，其中完熟期1揮發性組分種類最少，而在完熟期4中揮發性組分種類最多；不同完熟期揮發組分的含量不同，對于萜烯類和醇類組分，在完熟期1中含量最高，而在完熟期4中含量最低；對于醛類和酯類組分，在完熟期4含量最高，而完熟期1中含量最低；對于異味組分VSCs，在完熟期3含量最高，而在完熟期1中含量最低?？死锫￠僦腜CA可知，在完熟期1的果汁樣品與萜烯類化合物密切相關，而其他完熟期果汁樣品與萜烯類、醇類、醛類、酯類化合物密切相關。OAV明確了D-檸檬烯(橘香)、β-月桂烯(香脂味)、芳樟醇(花香)是克里曼丁橘汁中最主要的特征風味組分。在不同完熟期，醛類特征組分種類變化最大，呈現先升高后降低的趨勢，在完熟期4達到最大值。此外，加工處理促進克里曼丁橘汁中異味組分甲硫醇和甲硫醚的產生，其在完熟期1和4中含量較低，且與其他完熟期VSCs相比，差異顯著(P<0.05)?；诖?，后續將利用GC-MS結合嗅辨儀對貯藏、貨架期間的克里曼丁果汁中關鍵特征香氣組分的變化規律進行研究，以解決貯藏和銷售過程中克里曼丁果汁風味劣變問題。

表3 不同成熟期克里曼丁紅橘果汁中揮發性物質的OAV值Table 3 The OAV of volatile compounds in clementine juice at different stages of complete maturity