工業蘿卜泡菜發酵過程中理化特性及真菌群落多樣性分析

唐麗，魏雯麗，趙雅嬌，于文平，吳正云，曾里，張文學,2*

1(四川大學 輕工科學與工程學院，四川 成都，610065)2(四川大學 錦江學院白酒學院，四川 眉山，620860)

四川泡菜歷史悠久，因其富含維生素、礦物質、有機酸和益生菌而成為家喻戶曉的開胃菜和佐菜，并已從傳統小型家庭作坊式生產發展為工業化大規模生產[1]。工業泡菜大多是使用食鹽直接腌制新鮮蔬菜而成，而蘿卜泡菜是其中的典型代表。蘿卜是四川盆地種植的主要農作物之一，且蘿卜泡菜由于其質地口感好、藥用價值高和營養價值豐富而成為重要的發酵蔬菜之一[2]。

近年來，隨著分子微生物學技術的高速發展，高通量測序技術已經廣泛運用于發酵豆制品[3-5]、腐乳[6]、醬醋[7]、酸魚[8]、發酵茶[9]和發酵蔬菜[10]等傳統發酵食品的微生物群落結構分析。LIANG等[11]研究表明四川工業榨菜泡菜發酵過程中細菌是主要的活性微生物，乳酸桿菌(Lactobacillus)是發酵中后期的優勢細菌屬。LIU等[12]闡明了中國南方傳統泡菜和北方辣白菜在細菌群落結構上的差異，且總酸、乳酸和乙酸與辣白菜細菌群落呈正相關，與傳統泡菜細菌群落呈負相關。RAO等[13]研究發現在傳統腌制蘿卜中乳酸桿菌是優勢細菌屬，畢赤酵母(Pichia)和假絲酵母(Candida)是優勢真菌屬。呂嘉櫪等[14]通過高通量測序發現不同原料的傳統老壇自然發酵泡菜的真菌群落結構不同。因此現有研究大多關注于家庭泡菜中的細菌多樣性，對工業泡菜和真菌多樣性研究較少。迄今為止，尚未見到針對不同工藝四川工業泡菜發酵過程中的真菌多樣性研究報道。

本實驗采用高通量測序技術對不同工廠蘿卜泡菜發酵過程中真菌多樣性進行分析，同時結合理化指標的變化，揭示工業蘿卜泡菜發酵過程中真菌群落結構的演替規律，以期對工業蘿卜泡菜發酵工藝的全面優化和發酵過程的精準調控提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

NaOH、亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、冰醋酸、四硼酸鈉、對氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、亞硝酸鈉(分析純)，成都市科龍化工試劑廠；草酸、酒石酸、乳酸、乙酸、蘋果酸、琥珀酸、檸檬酸(色譜純)，天津科密歐化學試劑公司；DNeasy PowerSoil Kit試劑盒，德國QIAGEN公司；AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒，美國Axygen Biosciences公司。

1.2 儀器與設備

PHS-3C酸度計，上海儀電科學儀器股份有限公司；WS202鹽度計，上海民儀電子有限公司；LC-2030高效液相色譜儀，日本島津公司；MyCyclerTMThermal Cycler PCR儀，美國Bio-Rad公司；DYY-5瓊脂糖凝膠電泳儀，中國北京市六一儀器廠；Legend Micro 17R高速冷凍離心機，美國賽默飛公司；Illumina HiSeq 2 500測序平臺，美國Illumina公司。

1.3 實驗與方法

1.3.1 樣品采集

采集四川眉山兩個工廠(J廠和W廠)的發酵蘿卜漬液進行分析，以新鮮蘿卜下池經石壓7 d左右出水時為取樣第0天，后續第30、60、120、180、240天分別取樣。取樣后用冰袋迅速運回實驗室置于-80 ℃冰箱備用。

1.3.2 理化指標的檢測

采用pH計和鹽度計分別測定pH值和鹽度值；參照GB/T 12456—2008《食品總酸的測定》測定樣品中總酸含量；采用鹽酸萘乙二胺法測定亞硝酸鹽含量。

采用高效液相色譜法測定有機酸含量。樣品處理：在4 ℃條件下以10 000 r/min離心15 min，上清液用0.22 μm水系膜過濾。測定條件：色譜柱為Agilent ZORBAX-SB C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相為V(0.1%的磷酸緩沖液)∶V(甲醇)=95∶5，流速0.8 mL/min，柱溫40 ℃，進樣量10 μL。紫外檢測器波長210 nm，通過與標準品的保留時間和峰面積的比較，對其進行定性和定量。

1.3.3 DNA提取與測序

采用DNeasy PowerSoil Kit試劑盒提取發酵蘿卜漬液中微生物總DNA。使用ITS真菌通用引物：ITS1F(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)，ITS2R(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)對總DNA進行PCR擴增。擴增體系為：5 μL Q5反應緩沖液(5×)，5 μL Q5保真GC緩沖液(5×)，0.25 μL 高保真DNA聚合酶(5 U/μL)，2 μL(2.5 mmol/L)三磷酸堿基脫氧核苷酸(dNTPs)，前后引物各1 μL(10 μmol/L)，2 μL DNA模板，8.75 μL ddH2O。擴增程序為：98 ℃預變性2 min，98 ℃變性15 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環35次，最后72 ℃延伸5 min。PCR擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。采用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒回收純化PCR產物，用ABI Step OnePlus實時熒光定量PCR儀進行定量檢測，送至上海派森諾生物科技有限公司進行測序，測序平臺為Illumina HiSeq 2500。

1.3.4 測序數據分析

用QIIME計算Alpha多樣性，包括 Chao1、Simpson、Shannon和Good′s coverage，以表征真菌群落結構的豐富度和多樣性。使用非加權組平均法(unweighted pair-group method with arithmetic mean, UPGMA)構建樹狀結構。結合UNITE數據庫(Release 8.0, http://unite.ut.ee/)進行物種注釋。

2 結果與分析

2.1 工業蘿卜泡菜發酵過程的理化指標分析

總酸(total acid，TTA)和pH是衡量泡菜發酵程度的重要指標。如圖1所示，在發酵剛啟動時，兩廠的蘿卜泡菜的總酸含量較低，從60 d時開始迅速升高，直至240 d達到最高點，pH則與總酸含量趨勢相反，在整個發酵過程中逐漸降低，到發酵終止時在4.0左右。由圖1-a、圖1-b可知，0 d時J廠母水的pH(6.37)要高于W廠(5.30)，J廠總酸含量(1.33 g/kg)卻高于W廠(0.06 g/kg)，猜測與2個工廠的蘿卜在封池前堆放的時間有關。鹽度在一定程度上決定了泡菜的品質。由圖1-c、圖1-d可知，發酵前60 d，兩廠蘿卜泡菜的鹽度不斷增加，最高到15%左右，隨后基本維持穩定，但J廠的鹽度始終高于W廠，這會抑制一些不耐鹽微生物的生長，導致兩廠真菌群落結構的差異。亞硝酸鹽含量在兩廠的蘿卜泡菜中均呈波動變化的趨勢，發酵后期基本維持在8.34 mg/kg(J廠)和5.44 mg/kg(W廠)，低于國標中的20 mg/kg的限量標準。除0 d外，J廠的亞硝酸鹽含量均高于W廠。

有機酸是四川泡菜發酵中的重要呈味物質，且與微生物代謝活動密切相關。兩廠蘿卜泡菜發酵過程中的有機酸含量變化如表1所示，共檢測到7種有機酸，其中，含量最高的是來自蘿卜泡菜原料中的草酸。隨著發酵的進行，蘿卜和母水中存在的豐富微生物開始生長代謝，草酸被不斷分解,含量逐漸降低，而乳酸和乙酸含量明顯增加，并且在發酵后期乳酸濃度是所有有機酸中最高的。這和工業豇豆泡菜[15]的研究結果一致。240 d時J廠的乳酸含量增加到9.82 g/kg，占整個有機酸總量的29.13%，W廠到240 d時乳酸含量為5.64 g/kg，占24.73%。蘿卜泡菜在發酵120 d時才產生酒石酸，隨后J廠酒石酸含量從0.31 g/kg增加到1.93 g/kg，W廠則在3.83 g/kg處小幅波動。檸檬酸和琥珀酸在兩廠的發酵過程中均呈先增加再減少的趨勢，而有較大差異的蘋果酸在J廠含量最高為2.82 g/kg(120 d)，在W廠為1.71 g/kg(240 d)。

a-TTA；b-pH；c-鹽度；d-亞硝酸鹽含量圖1 工業蘿卜泡菜發酵過程中TTA、pH、鹽度及亞硝酸鹽含量的動態變化Fig.1 Dynamic changes of TTA, pH and the contents of salinity, nitrite during the fermentation of industrial radish paocai

表1 工業蘿卜泡菜發酵過程中有機酸含量的變化 單位：g/kg

2.2 Alpha多樣性分析

通過Illumina Miseq測序，為了保證樣本測序序列的均一性，對所有樣品有效序列按最小樣本序列數進行抽平(每個樣本45 629條有效序列)。抽平后，所有樣品序列歸屬于12個門，37個綱，74個目，176個科，299個屬，480個種。Alpha多樣性指數，包括Chao1、Simpson、Shannon和Good′s coverage，常用于表征在環境中微生物群落的豐富度以及多樣性情況。每個樣品的Good′s coverage值均達0.999 9，表明測序深度良好，可以較真實展示樣品中的絕大多數真菌的群落結構(表2)。J廠蘿卜泡菜的Chao1指數隨著發酵的進行先增加后減少，在發酵60 d時真菌群落豐富度達到最高。而W廠發酵第0天的Chao1指數最大且高于J廠，表明W廠在發酵第0天真菌群落豐富度最高，經過發酵作用后菌群豐富度有所降低。J廠的Simpson和Shannon指數值隨著發酵呈下降趨勢，W廠的真菌群落多樣性變化趨勢則與豐富度類似，這可能是由于不同工廠發酵初始母水的酸度和鹽度不同。

2.3 Beta多樣性分析

在真菌操作分類單元(operational taxonomic unit,OTU)分類水平上，對J廠和W廠不同發酵時期蘿卜泡菜樣品進行主成分分析(圖2)，以樣本點之間的距離來衡量其真菌群落結構組成的相似或差異程度。不同樣本真菌群落結構信息主要集中在前3個主成分，其累計方差貢獻率為84.45%，PC1的貢獻率為49.18%， PC2的貢獻率為24.43%。其中，PC1可以區分不同發酵時間工業蘿卜泡菜真菌群落結構的差異性，PC2可以區分不同工廠的工業蘿卜泡菜樣品。分析發現36個樣品出現明顯的聚類趨勢，可將整個發酵過程分為發酵起始點(0 d)、前期(30～60 d)、中期(60～180 d)和后期(180～240 d)。

表2 Alpha多樣性指數分析Table 2 The analysis of Alpha diversity estimators

圖2 工業蘿卜泡菜真菌群落主成分分析Fig.2 Principal component analysis of fungi community structure in industrial radish paocai

2.4 真菌群落結構多樣性和演替規律分析

在門水平上，各廠不同發酵時期蘿卜泡菜樣品真菌群落組成如圖3-a所示。去除未分類的真菌后，所有樣品中真菌群落共包含10個門，其中子囊菌門(Ascomycota)為絕對優勢菌門，相對豐度為42.7%～99.9%。其次為擔子菌門(Basidiomycota)，其相對豐度為 0.01%～56.9%，這與吳進菊等[16]在發酵大頭菜的研究結果一致。在兩個不同工廠蘿卜泡菜中，擔子菌門在發酵前期相對豐度較高，且均呈先增后減的趨勢，W廠發酵第0天和第30天擔子菌門的相對豐度超過50%，而J廠在第0天時相對豐度僅為4.58%，隨后增加到27.66%(30 d)。發酵到120、180、240 d 時，則子囊菌門(99%)主導了整個發酵中后期。

在兩廠36個蘿卜泡菜樣品中共鑒定出230個屬，其中樣品J60-2檢測到屬水平微生物數量最多(106個)，W120-3檢測到屬水平微生物數量最少(5個)。選取其相對豐度較高的前20個優勢屬(至少占每個樣品總相對豐度85%以上)，包括假絲酵母屬(Candida)、Starmerella、德巴利氏酵母屬(Debaryomyces)、Tausonia、梗孢酵母屬(Sterigmatomyces)和畢赤酵母屬(Pichia)，各廠蘿卜泡菜發酵過程中優勢屬的動態變化如圖3-b所示。假絲酵母屬在兩廠發酵過程相對豐度中先減后增，蘿卜泡菜發酵前期的優勢屬為德巴利氏酵母屬，假絲酵母屬和德巴利氏酵母屬是泡菜中常見的真菌屬[17-18]。

a-門水平；b-屬水平圖3 門水平及屬水平上工業蘿卜泡菜真菌群落結構多樣性Fig.3 Diversity of fungal community structure of industrial radish paocai based on phylum and genus level

由圖3-b可知，J工廠蘿卜發酵過程優勢菌屬為假絲酵母屬(3.02%～99.38%)、德巴利氏酵母屬(0.05%～64.83%)、畢赤酵母屬(0.04%～33.01%)和Starmerella(0.04%～72.75%)。發酵第0天，假絲酵母屬(57.84%)和畢赤酵母屬(33.01%)為J廠母水中的優勢微生物，隨后顯著下降，同時德巴利氏酵母屬迅速成為發酵前期的優勢屬。Starmerella在發酵120 d相對豐度很高(72.75%)，隨后減少。畢赤酵母屬是J工廠蘿卜0 d特有的優勢真菌屬，適合在弱酸環境中生存，也具有一定的產膜能力[19]；Starmerella在以往泡菜的研究中很少出現，在發酵葡萄酒中出現較多，對腐敗微生物有一定的抑制能力[20]。

由圖3-b可知，W工廠蘿卜發酵過程優勢菌屬為梗孢酵母屬(0.04%～43.88%)、假絲酵母屬(0.26%～44.76%)、德巴利氏酵母屬(0.29%～84.13%)、Tausonia(0.09%～56.68%)和Starmerella(0.25%～97.92%)。與J廠不同的是，W廠發酵第0天物種豐富度最高，且優勢真菌屬為梗孢酵母屬(43.88%)。發酵前期除德巴利氏酵母屬外，Tausonia在30 d相對豐度占56.68%，隨后驟降。Starmerella在發酵中期為絕對優勢真菌屬(97.92%)，后期隨著假絲酵母屬的活躍而相對豐度略有降低。梗孢酵母屬和Tausonia分別是W工廠蘿卜0、30 d特有的優勢真菌屬，其中梗孢酵母屬在白酒大曲和紅曲醋醅中有報道出現[21-22]，Tausonia在土壤微生物的報道中出現過[23-24]，可能是新鮮蘿卜本身攜帶進入發酵池。

2.5 真菌群落和理化因子關聯性分析

將不同工廠蘿卜泡菜4個理化指標(pH、TTA、鹽度、亞硝酸鹽)和7種有機酸作為環境因子，同時各自選取相對豐度較高的10個真菌屬，進行冗余分析(redundancy analysis, RDA)，分析結果見圖4。在RDA圖中各環境因子箭頭越長表示對微生物群落結構的影響越大。箭頭連線與排序軸的夾角以及箭頭連線之間的夾角表示相關性，銳角表示正相關，鈍角表示負相關[25]。TTA(45.3%)和pH(29.1%)對J廠蘿卜泡菜發酵過程中真菌群落結構影響較大，TTA與假絲酵母屬呈顯著正相關(P<0.05)，檸檬酸與德巴利氏酵母屬呈顯著正相關；酒石酸(51%)是驅動W廠蘿卜泡菜真菌群落結構變化的主要因素，草酸與Tausonia呈顯著正相關?？偟恼f來，pH、鹽度、檸檬酸和草酸與發酵前期的真菌群落結構呈正相關，蘋果酸、乙酸與發酵中期呈正相關，TTA、亞硝酸鹽、乳酸和酒石酸與發酵后期呈正相關。

a-J廠；b-W廠圖4 工業蘿卜泡菜真菌群落的冗余分析Fig.4 The redundancy analysis of fungi in industrial radish paocai

3 結論

本研究采用高通量測序對J廠和W廠發酵過程中蘿卜泡菜的真菌多樣性和群落結構的演替規律進行研究。在發酵過程中，兩廠的蘿卜泡菜總酸濃度不斷增加，pH和草酸含量逐漸下降，鹽度先升高后緩慢降低，而J廠的亞硝酸鹽和乳酸含量高于W廠，后者pH、鹽度和乙酸含量更高。經OTU分析，36份樣品中共發現12個門，37個綱，74個目，176個科，299個屬，480個種。通過主成分分析發現，36個樣品可根據真菌群落結構特征將發酵的整個過程分為4個不同的階段。所有樣品中的優勢菌門均為子囊菌門，其次為擔子菌門。屬水平上，假絲酵母屬在兩廠發酵過程中相對豐度先減后增，德巴利氏酵母屬在蘿卜泡菜發酵前期是優勢屬，發酵中期優勢屬為Starmerella。畢赤酵母屬是J廠發酵0 d特有的優勢真菌屬，梗孢酵母屬和Tausonia分別是W工廠蘿卜0、30 d特有的優勢真菌屬。此外，RDA表明，pH、鹽度、檸檬酸和草酸與發酵前期的真菌群落結構呈正相關，蘋果酸、乙酸與發酵中期呈正相關，TTA、亞硝酸鹽、乳酸和酒石酸與發酵后期呈正相關。本研究揭示了不同生產工藝對四川工業蘿卜泡菜真菌群落結構及其動態變化的影響，為工業蘿卜泡菜發酵工藝的優化提供一定的理論基礎，同時對今后四川泡菜的工業化、標準化生產具有重要的意義。