玄參配方顆粒含量測定和特征圖譜測定方法研究

楊曉彬，黃 勇，陳丹純，江澤鴻

(康美藥業股份有限公司，廣東 普寧 515300)

中藥材玄參(ScrophularianingpoensisHemsl.)為玄參科草本植物的干燥根，有清熱涼血、滋陰降火、解毒散結的功效。主要用于熱入營血、溫毒發斑、熱病傷陰、舌絳煩渴、津傷便秘、骨蒸勞嗽等[1]。

玄參多糖含量較高，容易發生吸潮、霉變和生蟲現象，不易儲存[2]。玄參配方顆粒是以符合炮制規范的玄參飲片為原料，經過現代工藝加工制成的一種統一規格、統一質量標準的新型配方用藥，該藥既可保證原中藥飲片的特征，能滿足醫師進行辨證論治，隨癥加減，同時又具有不需要煎煮、直接沖服、服用量少、安全衛生、攜帶保存方便、易于調制和適合工業化生產等許多優點[3]。玄參已經分離出的化學成分有50多種，主要是環烯醚萜、苯丙素苷、有機酸及揮發油等，環烯醚萜苷中哈巴俄苷和哈巴苷對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠甲單孢菌均具有抗菌活性[4]。

本研究采用超高效液相色譜法對玄參配方顆粒的哈巴俄苷和哈巴苷的含量測定方法和特征圖譜測定方法進行檢驗，為玄參配方顆粒替代傳統藥材的可行性研究和臨床研究提供可行性依據。

1 儀器與試藥

Agilent 1290 InfinityⅡ超高效液相色譜儀(二元泵、自動進樣器、二極管陣列檢測器，美國安捷倫公司)；OpenLAB CDS工作站(美國安捷倫公司)；ACQUITY UPLC? BEH C18色譜柱(1.7 μm，2.1 mm×100 mm，美國Waters)；ACQUITY UPLC? HSS T3色譜柱(1.8 μm，2.1 mm×100 mm，美國Waters)；梅特勒-托利多XS205DU電子天平(十萬分之一，瑞士梅特勒-托利多)；超聲機(KQ-700VDB，昆山市超聲儀器有限公司)。

甲醇(KRUDE，880502)、乙腈(KRUDE，880601)、磷酸(CNW，8620060)均為色譜純，水為超純水。

哈巴苷對照品(批號111729-201707，96.8%，中國食品藥品檢定研究院)；哈巴俄苷(批號111730-201709，95.9%，中國食品藥品檢定研究院)；桃葉珊瑚苷(批號111761-201707，100%，中國食品藥品檢定研究院)；毛蕊花糖苷(批號111530-201713，92.5%，中國食品藥品檢定研究院)；玄參對照藥材(批號121008-201609，中國食品藥品檢定研究院)。

玄參配方顆粒(6批配方顆粒成品批號：1708014、1708015、1708016、2004016、2004017、2004018，康美藥業股份有限公司)。

2 方法與結果

2.1 哈巴苷與哈巴俄苷含量測定

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取取哈巴苷對照品、哈巴俄苷對照品適量，加70%甲醇制成每 1 mL 含哈巴苷60 μg、哈巴俄苷20 μg 的混合溶液，即得玄參配方顆粒對照品混合溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 取玄參配方顆粒，研細，約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇 50 mL，密塞，稱定重量，超聲處理(功率 350 W，頻率 45 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用 70%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得玄參配方顆粒供試品溶液。

2.1.3 色譜分析條件 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(ACQUITY UPLC? BEH C18，1.7 μm，2.1 mm×100 mm)；以乙腈為流動相 A，以0.03%磷酸溶液為流動相 B，按表1中的規定進行梯度洗脫；流速為每分鐘0.425 mL；測波長為210 nm(前7.5 min)，后變換為280 nm。理論板數按哈巴俄苷和哈巴苷計算均應不低于5 000。

表1 梯度洗脫

2.2 方法學考察

2.2.1 專屬性考察 分別取對照品溶液、配方顆粒供試品溶液和陰性樣品溶液進行檢測，結果表明，樣品中各個峰分離較好，峰型對稱，且陰性無干擾，表明該法專屬性良好。見圖1、圖2。

圖1 陰性樣品溶液色譜

2.2.2 精密度試驗 精密吸取混合對照品溶液2 μL，連續進樣6次，測得哈巴苷和哈巴俄苷的峰面積RSD均為0.2%，保留時間RSD為0.6%，表明儀器精密度良好。

2.2.3 線性關系考察 精密稱取取哈巴苷對照品、哈巴俄苷對照品適量，精密稱定，加70%甲醇制成哈巴苷系列對照品溶液(15 μg/mL，30 μg/mL，60 μg/mL，90 μg/mL，120 μg/mL)、哈巴俄苷系列對照品溶液(5 μg/mL，10 μg/mL，20 μg/mL，30 μg/mL，40 μg/mL)，分別吸取2μL進樣，測定其峰面積，以濃度(X)為橫坐標，峰面積(Y)為縱坐標，計算回歸方程，結果顯示哈巴苷回歸方程：y=1.698x+0.625 34(r=0.999 937)，表明哈巴苷在15～120 μg/mL范圍內具有良好的線性；哈巴俄苷回歸方程：y=11.39701x+0.99622(r=0.999 949)，表明哈巴俄苷在5～40 μg/mL范圍內具有良好的線性。

2.2.4 重復性試驗 取同一批玄參配方顆粒，按照“2.1.2”項下供試品溶液的制備方法制備6份供試品溶液，精密吸取2 μL進樣，測得哈巴苷和哈巴俄苷的含量平均值分別為2.325 mg/g和0.703 mg/g，RSD分別為0.8%和0.6%，表明該方法重復性良好。

2.2.5 加樣回收試驗 取已知含量的同一批樣品各0.5 g，精密稱量6份，分別添加一定量的哈巴苷、哈巴俄苷對照品，按照“2.1.2”項下供試品溶液的制備方法制備6份供試品溶液，精密吸取2 μL進樣，測定并計算各成分的加樣回收率以及RSD，結果見表2。哈巴苷、哈巴俄苷的平均回收率在95%～102%之間，且RSD均小于2%，表明該方法準確度良好。

表2 哈巴苷、哈巴俄苷回收率

2.2.6 穩定性考察 取同一批玄參配方顆粒，按照“2.1.2”項下供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，分別于制備后0、2、4、8、12、16、18、24、36、48 h精密吸取2 μL進樣，以哈巴苷、哈巴俄苷峰面積為參照，計算其余各峰的相對保留時間和哈巴苷、哈巴俄苷。結果各峰的相對保留時間和哈巴苷、哈巴俄苷含量無明顯變化，RSD<2%，表明在48 h內供試品供試液穩定。

2.3 含量測定結果

按照“2.1.2”項下供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，測定哈巴苷、哈巴俄苷的總量，結果如表3。結果表明，6批玄參配方顆粒哈巴苷、哈巴俄苷的總量均大于3 mg/g。

表3 玄參配方顆粒含量測定結果 (mg/g)

3 玄參配方顆粒特征圖譜分析

3.1 參照物溶液的制備

取玄參對照藥材 0.3 g，置具塞錐形瓶中，加入 30%甲醇25 mL，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，搖勻，濾過，取續濾液，作為對照藥材參照物溶液。另取桃葉珊瑚苷、哈巴苷、毛蕊花糖苷、哈巴俄苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含桃葉珊瑚苷20 μg、哈巴苷50 μg、毛蕊花糖苷20 μg、哈巴俄苷20 μg 的溶液，作為對照品參照物溶液。

3.2 供試品溶液的制備

取本品適量，研細，取0.2 g至具塞錐形瓶中，加入 30%甲醇25 mL，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，搖勻，濾過，取續濾液，即得供試品溶液。

3.3 色譜條件

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(ACQUITY UPLC? HSS T3，1.8 μm，2.1 mm×100 mm，美國Waters)；以乙腈為流動相 A，以0.1%磷酸溶液為流動相 B，按表4中的規定進行梯度洗脫，流速為每分鐘0.3 mL、柱溫為30 ℃、檢測波長為210 nm，理論塔板數按哈巴俄苷峰計算應不低于5 000。

表4 梯度洗脫

3.4 方法學考察

3.4.1 精密度試驗 精密吸取對照品參照物溶液1 μL，連續進樣6次，計算各個峰的相對保留時間和峰面積，測得峰面積RSD均小于1%，保留時間RSD<0.6%，表明儀器精密度良好。

3.4.2 重復性試驗 取同一批玄參配方顆粒，按照“3.2”項下方法制備6份供試品溶液，精密吸取1 μL進樣，以哈巴俄苷為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，結果相對保留時間和相對峰面積的RSD分別為0.4%和1.1%，表明該方法重復性良好。

3.4.3 穩定性考察 取同一批玄參配方顆粒，按照“3.2”項下方法制備供試品溶液，分別于制備后0、2、4、8、12、16、18、24、36、48 h精密吸取1μL進樣，以哈巴俄苷為參照峰，計算相對保留時間和相對峰面積，結果相對保留時間和相對峰面積無明顯變化，RSD<2%，證明供試品供試液在48 h內穩定。

3.5 特征圖譜研究

玄參配方顆粒UPLC特征圖譜的建立與相對保留時間研究：按“3.1”項下方法制備對照品參照物溶液和對照茵陳參照物溶液，按“3.2”項下方法制備6批樣品供試品溶液，按“3.3”項下色譜分析條件記錄0～20 min色譜圖，通過匹配，生成對照圖譜，建立玄參配方顆粒UPLC特征圖譜，見圖3、圖4。6批玄參配方顆粒UPLC特征圖譜中，均有6個特征峰，其中，1、2、3、5號峰分別為桃葉珊瑚苷、哈巴苷、毛蕊花糖苷、哈巴俄苷，哈巴俄苷峰面積大，重現性好，可作為參照峰，計算4、6號峰與5號峰的相對保留時間，在規定值的5%范圍之內。2個特征峰的相對保留時間分別為0.82(峰4)、1.05(峰6)，見表5。

圖3 玄參配方顆粒UPLC特征圖譜

圖4 6批玄參配方顆粒UPLC特征圖譜

表5 玄參配方顆粒6個峰的保留時間 (min)

4 討論

有研究表明玄參經炮制后可使哈巴俄苷含量下降，而使哈巴苷含量升高[5]，因此本研究將測定玄參配方顆粒中哈巴俄苷和哈巴苷的總量作為控制玄參配方顆粒質量的方法之一。由于中藥材的復雜性，建立準確有效的鑒別方法——特征圖譜，可以從客觀整體上評價中藥材的質量，超高效液相色譜法與普通液相色譜法相比，靈敏度更高、速度更快，因此本實驗將UPLC定量測定和特征圖譜相結合，在測定哈巴俄苷和哈巴苷總量的基礎上對玄參配方顆粒特征圖譜進行研究，為玄參配方顆粒的質量控制和評價提供了參考依據。